Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

Общая цель интраспинальной доставки рекомбинантных аденоассоциированных вирусов заключается в том, чтобы обеспечить гистологическую маркировку и функциональные манипуляции с генетически определенными нейронами в дорсальном спинном мозге. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области боли, например, какие нейронные цепи необходимы для восприятия различных модальностей боли. Основное преимущество этого метода заключается в том, что генетически помеченными нейронами можно манипулировать специально ограниченным и контролируемым во времени образом.

Найдите самую каудальную пару ребер путем пальпации вдоль позвоночного столба мыши, находящейся под наркозом. Затем сделайте продольный разрез от 1,5 до 2,5 сантиметра в коже, начиная только с ростраль до самой каудальной пары ребер. Подтяните кожу с помощью щипцов и отсоедините ее от основной мышцы с помощью ножниц.

На протяжении всей операции поддерживайте открытые ткани во влажном состоянии с помощью стерильного 0,9% хлорида натрия. С помощью тонких щипцов и маленьких ножниц сделайте надрез в соседнем с тонким пленчатым слоем, прямо рядом со средней линией, и разрежьте его подальше от остистых отростков. Несколько анатомических ориентиров могут помочь в определении правильных позвонков для цели.

Здесь мы опишем три альтернативы. Пальпируйте вдоль позвоночного столба. Самая каудальная пара ребер расположена как раз рострально к позвонкам Т13, а тазовая кость на уровне бедра находится на уровне позвонков L6.

В качестве альтернативы оттяните кожу к хвосту, чтобы обнажить подвздошный гребень. На этом же уровне самая каудальная пара видимых межпоперечных связок присоединяется к отростку L6 позвоночника. Считайте в обратном направлении от каудального к ростральному, чтобы определить интересующие позвонки.

В противном случае найдите место, где сухожилие вдоль боковой части позвоночного столба является наиболее белым и медиальным. Позвонки Т13 расположены как раз рострально. Сегмент поясничного отдела спинного мозга L4 расположен внутри этого позвонка.

Далее поместите животное на подушку из свернутых салфеток, чтобы приподнять его к спинномозговым зажимам стереотаксической рамы. Совместите зажимы рядом с целевыми позвонками. Зафиксируйте один зажим на месте, затем удерживайте позвоночный столб щипцами Адсона во время фиксации второго зажима.

Подтвердите правильность зажима, осторожно надавливая на целевые позвонки. Затем удалите остистую мышцу над интересующими позвонками. Сначала сделайте разрез прямо медиально к сухожилиям, параллельным позвоночному столбу.

Затем сделайте перпендикулярные разрезы ростральный и каудальный по отношению к целевым позвонкам. Затем с помощью ронжеров оторвите или отрежьте параостистую мышцу над интересующими позвонками. Используйте щипцы по мере необходимости для удаления ткани, оставшейся на позвонках или над твердой мозговой оболочкой во внутривертебральном пространстве.

Теперь должен быть виден дорсальный кровеносный сосуд, обозначающий среднюю линию спинного мозга. Для односторонних инъекций выполните частичную ламинэктомию с помощью тонкой стоматологической бормашины, оснащенной сферическим резцом диаметром 0,5 миллиметра, чтобы очень аккуратно просверлить отверстие в середине целевой стороны позвонков. Удалите все оставшиеся костные фрагменты с помощью скошенной иглы 26 калибра, чтобы обнажить спинной мозг.

С помощью иглы перфорируют твердую мозговую оболочку во внутривертебральных пространствах рострально и каудально по отношению к целевым позвонкам, примерно на 300 мкм латеральнее дорсального кровеносного сосуда. Затем продырявите твердую мозговую оболочку под просверленным отверстием. В этот момент спинномозговая жидкость должна выходить из отверстий, а спинной мозг должен немного выпячиваться.

Приготовьте шприц для инъекций, сначала установив стеклянный капилляр на микролитровый шприц. Плотно затяните гайку, чтобы обеспечить плотное и надежное прилегание. Наполните микролитровый шприц стерильной дистиллированной водой, затем нажмите на поршень.

Если вода не вытесняется из наконечника, скорее всего, микропипетка заблокирована и ее следует заменить. Установите шприц на микроманипулятор, подключенный к микроинъектору с электронным управлением. Затем с помощью микроинъектора наберите около одного микролитра воздуха, чтобы отделить воду и вирус.

Далее нанесите пипеткой каплю 2,5 микролитра разведенного раствора вируса на кусок парафиновой пленки. Осторожно переместите кончик микропипетки в каплю с помощью стеротаксической рамки и втяните его вверх в микропипетку. Затем нажимайте кнопку дозирования до тех пор, пока капля вирусного раствора не появится на кончике.

Втяните шприц и с помощью ручки отметьте микропипетку шкалой, чтобы контролировать выдаваемый объем. С помощью стереотаксической руки переместите кончик микропипетки над одним из отверстий в твердой мозговой оболочке, а затем вниз до тех пор, пока на поверхности обнаженного спинного мозга не появится небольшое углубление. Чтобы нацелить инъекцию на спинной спинной рог, переместите кончик вниз на глубину 500 микрон с шагом 100 микрон, а затем вверх на 200 микрон, чтобы обеспечить механическую стабилизацию ткани.

Конечная глубина наконечника составляет 300 мкм. Запрограммировав насос на впрыскивание 300 нанолитров со скоростью впрыска 50 нанолитров в минуту, нажмите кнопку запуска, чтобы начать инфузию. После завершения инъекции проверьте шкалу на микропипетке, чтобы увидеть, снизился ли уровень вируса.

Оставьте микропипетку на месте еще на три минуты, чтобы давление сбалансировалось. Через три минуты медленно втяните микропипетку, а затем повторите процедуру для двух других мест инъекций. После заключительной инъекции снимите спинальные зажимы и подушку под мышью.

Закройте слои разрезов прерывистыми швами, сшивая поверхностные слои тканей рассасывающимися нитями и кожу нерассасывающимися швами. Нанесите на зашитую рану йодное дезинфицирующее средство. Прекратите действие анестезии и оставьте животное на тепловом коврике до тех пор, пока оно не придет в себя, прежде чем вернуть его в домашнюю клетку.

В конце эксперимента исследуется спинномозговая ткань в месте инъекции. Это необходимо для проверки успешности инъекции и трансдукции, а также для исключения чрезмерного повреждения тканей в результате операции. Чтобы проиллюстрировать уровни экспрессии, которые могут быть получены при внутриспинальной инъекции рекомбинантного AAV, вирус, кодирующий флуоресцентный белок eGFP, был введен в поясничный отдел спинного мозга мышей дикого типа.

Три инъекции, сделанные с интервалом примерно в один миллиметр, вызвали почти непрерывную инфекцию поясничных сегментов позвоночника от L3 до L5. Инъекция вируса на глубину до 300 мкм от поверхности спинного мозга приводит к преимущественному инфицированию клеток спинного мозга дорсального рога. Тем не менее, инфицированные клетки также могут быть обнаружены в брюшном роге. Cren-зависимый гибкий вектор, экспрессирующий eGFP, был введен в спинной мозг трансгенных мышей GlyT2:Cre.

Это привело к более ограниченной экспрессии eGFP, отражающей распределение GLYT2-положительных нейронов. Следование этому протоколу позволит нацелиться на три последовательных сегмента позвоночника. Мы обнаружили, что этого достаточно для получения устойчивых поведенческих результатов.

Эта методика позволит изучать функцию конкретных нейронов и клеточных популяций, а также сенсорных путей.