Долгосрочный клеток изображений для оценки судьбу клеток в ответ на паклитаксел

Общая цель этой процедуры заключается в использовании визуализации живых клеток для оценки решений о судьбе клеток после лечения антимитотическим препаратом паклитакселом. Этот метод позволяет визуализировать, как отдельные клетки реагируют на различные дозы антимитотического препарата паклитаксела. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предоставляет обширную информацию об отдельных клетках или целых популяциях, которую невозможно получить с помощью визуализации с фиксированными клетками или популяционных анализов.

Этот метод демонстрирует Марк Виттория, кандидат медицинских наук в лаборатории Ганема. Для начала очистите стеклянное дно чашки для визуализации оптическим очистителем, чтобы удалить отпечатки пальцев или пыль, которые могут помешать изображению. Используйте достаточное количество оптического очистителя, чтобы намочить всю поверхность стекла.

Поместите чашку со стеклянным дном с клетками на предметное столико для микроскопа в адаптере чашки для визуализации. Снимите пластиковую крышку с тарелки и накройте тарелку стеклянной камерой. Убедитесь, что в камере есть клапан, обеспечивающий постоянный поток воздуха, состоящий на 5% из углекислого газа.

Чтобы увлажнить 5% углекислый газ, газ пропускается через трубки, вставленные в корпус стерильной водяной бани. Это позволяет газу уравновеситься до влажности 95%. Инициация и калибровка закодированного предметного столика с помощью программного обеспечения, управляющего микроскопом.

Это обеспечит точные координаты XY и предотвратит смещение фокуса. Далее выполните подсветку Колера, подняв конденсатор и закрыв отверстие так, чтобы поле было темным. Опускайте конденсатор до тех пор, пока не станет видна четкая шестиугольная форма света.

Затем с помощью центрирующих винтов центрируйте шестиугольник света в поле зрения. Как только шестиугольная форма станет видимой, откройте отверстие до тех пор, пока не будет освещено все поле зрения. Включите автофокусировку микроскопа, чтобы убедиться, что все точки остаются в фокусе на протяжении всего эксперимента.

Используйте программное обеспечение для сбора данных, чтобы выбрать несколько неперекрывающихся полей обзора из каждой скважины для визуализации. Выберите области визуализации, где клетки хорошо прилипли к стеклянному дну и имеют конфлюентность от 50 до 70%. Избегайте участков со слипшимися клетками, так как это затруднит последующий анализ.

Чтобы оценить судьбу митотической клетки, настройте программное обеспечение для визуализации на сбор изображений из каждого выбранного поля зрения каждые 10 минут в течение 96 часов. Невозмущенный митоз длится от 20 до 40 минут, и, таким образом, 10-минутные интервалы обеспечат достаточный отбор проб для определения времени деления клеток. Чтобы выявить ядерный разрыв, который является преходящим событием, получайте снимки каждые пять минут.

Идентификация клеток, вступающих в митоз, путем наблюдения за округлением клеток, использованием фазово-контрастной оптики и/или конденсации хромосом с использованием человеческого гистона H2B, слитого с GFP. Как округление клеток, так и конденсация хромосом легко визуализируются на глаз. Аннотируйте время, когда клетка вступает в митоз.

Продолжайте отслеживать ячейку до тех пор, пока она не достигнет своей судьбы. Контрольные клетки должны эффективно выровнять свои хромосомы и войти в анафазу в течение одного часа. Визуализируйте анафазу с помощью фазово-контрастной оптики, когда клетка начинает сжиматься на две части, или с помощью визуализации хромосом, движущихся к полюсам, помеченных H2B-GFP.

Отмечайте время, когда клетка подвергается анафазе. Напротив, клетки, обработанные паклитакселом, будут оставаться округлыми с конденсированными хромосомами в течение нескольких часов. Определите митотически арестованные клетки, которые подвергаются клеточной гибели.

Клетки, которые умирают во время митоза, визуализируются с помощью фазово-контрастной микроскопии, поскольку клетки взрываются, сжимаются и/или разрываются. При визуализации H2B-GFP хромосомы также будут фрагментироваться во время гибели клеток. Определите митотически арестованные клетки, которые подвергаются соскальзыванию клеток.

Клетки, которые подвергаются митотическому проскальзыванию, наблюдаются с помощью фазово-контрастной микроскопии, поскольку они сплющиваются обратно в интерфазу и деконденсируются хромосомы, не подвергаясь анафазе. Эти клетки дают начало крупным тетраплоидным клеткам, которые часто являются многоядерными. Продолжайте отслеживание ячеек из исходного поля зрения.

После того, как все поле зрения будет отслежено, перейдите к отдельному полю зрения, полученному из той же лунки, и продолжайте отслеживание ячеек. Оцените судьбу клеток после митотического проскальзывания с использованием нетрансформированной и хромосомно стабильной линии пигментированных эпителиальных клеток сетчатки, экспрессирующей систему FUCCI. Чтобы убедиться в том, что система FUCCI работает правильно, убедитесь, что контрольные клетки соответствующим образом чередуют экспрессию красных и зеленых флуоресцентных белков на основе анализа данных визуализации живых клеток.

Контрольные клетки должны переходить от проявления полностью ядерной красной флуоресценции к проявлению полностью ядерной зеленой флуоресценции во время интерфазы по мере того, как клетки переходят от G1 к S-фазе. Клетки должны продолжать проявлять зеленую флуоресценцию на протяжении всего завершения митоза. Сразу после митоза клетки должны снова проявлять полностью красную флуоресценцию во время интерфазы.

Идентифицируйте клетки, остановленные при митозе, с помощью фазово-контрастной микроскопии и отслеживайте их до тех пор, пока они не подвергнутся митотическому проскальзыванию. Клетки, которые выскальзывают из митоза и возвращаются обратно в интерфазу, переходят от проявления зеленой флуоресценции во время митоза к красной флуоресценции во время фазы G1. Отслеживайте эти проскальзывающие клетки с помощью фазово-контрастной и эпифлуоресцентной визуализации на глаз, чтобы оценить их клеточную судьбу.

Определите клетки, которые повторно вступают в клеточный цикл. Эти клетки идентифицируются по изменению экспрессии флуоресценции от красного к зеленому с помощью системы FUCCI, которая указывает на переход G1/S. Выявление клеток, которые подвергаются остановке клеточного цикла G1.

Эти клетки идентифицируются по экспрессии красной флуоресценции, которая сохраняется более 24 часов. Кроме того, определите клетки, которые умирают в интерфазе. Эти клетки идентифицируются по разрыву клеток, блеббингу и сжатию с помощью фазово-контрастной томографии.

Представьте себе клетки, как и раньше. Флуоресцентный сигнал от тандемного димерного повтора RFP, слитого с сигналом ядерной локализации, или TDRFP-NLS, и H2B-GFP должен совместно локализоваться во время интерфазы. Митоз визуализируется путем округления клеток с помощью фазовой оптики и/или конденсации хромосом с помощью H2B-GFP.

При митозе ядерная оболочка разрушается, и сигнал TDRFP-NLS становится цитоплазматическим. После митоза ядерная оболочка в дочерних клетках реформируется, и сигнал TDRFP-NLS становится ядерным. Отслеживайте дочерние клетки на протяжении последующей интерфазы с помощью визуализации живых клеток.

Идентификация событий ядерного разрыва путем наблюдения за переходным всплеском локализованного в ядре TDRFP-NLS в окружающую цитоплазму. В течение нескольких минут ядерная оболочка будет восстановлена, и TDRFP-NLS будет перемещен в ядро. Здесь представлены репрезентативные изображения соскользнувшей клетки, которая становится зеленой и переходит в S-фазу после соскальзывания после лечения паклитакселом.

Большинство клеток, которые выскользнули из лечения паклитакселом, подверглись аресту G1/G0 и оставались красными более 48 часов, не подвергаясь апоптозу. Клетки, которые после соскальзывания окрашены в красный цвет, также подвергаются апоптозу, как показано на этом изображении. Разрыв ядерной оболочки увеличивается в клетках, обработанных паклитакселом.

Клетки TDRFP-NLS и H2B-GFP, обработанные 10-наномолярным паклитакселом, имеют повышенный разрыв ядра, при котором RFP будет делокализован от ядра к цитоплазме в интерфазных клетках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое понимание того, как выполнять долгосрочную визуализацию живых клеток для оценки судьбы клеток в ответ на различные методы медикаментозного лечения.