Синтез многостенные углеродные нанотрубки, модифицированных наночастиц серебра и оценки их антибактериальная деятельность и цитотоксических свойств

Общая цель этой процедуры заключается в получении антибактериальных нанокомплексов, состоящих из углеродных нанотрубок с наночастицами серебра, синтезированными на поверхности нанотрубок. Этот метод может быть использован при разработке новых бактериальных наноматериалов, которые обладают низкой токсичностью для человека, но при этом обладают сильными септическими свойствами для различных видов бактерий и биопленок. В протоколе описана оценка нанокомплексов в уничтожении бактерий при сохранении их биосопоставимости с человеком.

Чтобы начать процедуру, поместите от 30 до 50 миллиграммов MWCNTs в 50-миллилитровый флакон. С помощью микропипетки, оснащенной наконечниками для пипетки объемом один миллилитр, медленно добавьте восемь миллилитров раствора серной кислоты и азотной кислоты в соотношении три к одному по объему в MWCNT. Подождите 30 минут до окончания экзотермической реакции, затем обработайте раствор ультразвуком при температуре от 60 до 80 градусов Цельсия и 160 Вт, пока MWCNT не осядут на дне флакона, что обычно занимает около часа.

Переложите смесь в центрифужную пробирку. С помощью микропипетки осторожно добавьте 30 миллилитров дистиллированной воды по каплям в функциональные MWCNT карбоновой кислоты, делая паузу, чтобы смесь охладилась по мере необходимости. Затем центрифугируйте смесь при 12 000 г в течение 15 минут.

Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, оснащенной наконечником объемом в один миллилитр. Добавьте к твердому веществу пять миллилитров этанола и промойте стенки флакона дополнительным этанолом. Снова центрифугируйте смесь с теми же настройками и проверьте pH надосадочной жидкости с помощью pH-бумаги.

Продолжайте промывать твердые вещества центрифугированием в этаноле до тех пор, пока pH надосадочной жидкости не станет нейтральным, затем удалите надосадочную жидкость и добавьте в осадок один миллилитр дистиллированной воды. Диспергируйте функционализированные карбоновой кислотой MWCNTs в воде и сублимационно высушите дисперсию при температуре минус 60 градусов Цельсия под вакуумом. Поместите 10 миллиграммов лиофилизированных функционализированных карбоновых кислот MWCNT в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.

Добавьте в тюбик 30 миллилитров дистиллированной воды. Соедините шесть миллилитров 0,1 нормального нитрата серебра и 18 миллилитров дистиллированной воды в другой конической трубке объемом 50 миллилитров. Обработайте обе смеси ультразвуком при температуре 60 градусов Цельсия и 160 Вт в течение одного часа.

Затем, продолжая ультразвуковую обработку дисперсии MWCNT при 60 градусах Цельсия и мощности 160 Вт, добавьте раствор нитрата серебра по каплям в дисперсию MWCNT с помощью пипетки, оснащенной наконечником для дозатора объемом один миллилитр. После завершения добавления продолжайте ультразвуковую обработку смеси в течение одного часа, затем центрифугируйте смесь в течение 15 минут при 12 000 G при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость. Повторно диспергируйте серебряные MWCNT в 30 миллилитрах дистиллированной воды с помощью ультразвука при 24 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Повторите центрифугирование в 30 миллилитрах дистиллированной воды и удаление надосадочной жидкости дважды. Далее диспергируйте промытые серебряные ЖМТ в одном миллилитре дистиллированной воды методом ультразвука в течение пяти минут. Добавьте в дисперсию пять миллилитров этанола и перемешайте смесь при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем центрифугируйте смесь в течение 15 минут при 12 000 G при комнатной температуре и проверьте pH надосадочной жидкости. Удалите надосадочную жидкость и повторно диспергируйте смесь в пяти миллилитрах этанола путем вортексирования. Продолжайте промывать осадок в этаноле центрифугированием до тех пор, пока pH надосадочной жидкости не станет нейтральным.

Наконец, диспергируйте промытые серебряные MWCNT в одном миллилитре дистиллированной воды. Сублимационную сушку дисперсии при температуре минус 70 градусов Цельсия под вакуумом в течение 24 часов и хранение дисперсии в герметичной упаковке. Чтобы начать приготовление теста, смешайте и автоклавируйте 18,12 грамма агара R2A и один литр дистиллированной воды.

Дайте гелю остыть при комнатной температуре. Когда гель будет готов к заливке, поместите 10 миллилитров геля в 90-миллиметровые чашки Петри и дайте агару застыть. В вытяжном шкафу с помощью петли и стерилизованной в спиртовом пламени иглы нанесите 100 микролитров смеси видов метилобактерий на поверхность питательной среды.

Инкубируйте посуду при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов, затем смешайте 3,12 грамма бульона R2A с одним литром дистиллированной воды и автоклавируйте среду при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Используйте стерилизованную петлю и иглу для переноса колоний в питательную среду R2A. Инкубируйте образец в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 градусов Цельсия и 180 об/мин.

Измеряйте оптическую плотность на расстоянии 600 нанометров каждый час, пока оптическая плотность не станет больше 0,7. Далее приготовьте еще одну чашку Петри, содержащую 10 миллилитров агара R2A. Затем смешайте 3,12 грамма бульона R2A и восемь граммов агара с одним литром дистиллированной воды.

Автоклавируйте смесь при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Смешайте 100 микролитров культуры метилобактерий с агаровой смесью. Налейте 10 миллилитров геля, содержащего метилобактерии, на нижний слой R2A-агара в чашке Петри, затем приготовьте дисперсию желаемой концентрации лиофилизированных серебряных MWCNT в дистиллированной воде.

С помощью микропипетки загрузите 50 микролитров этой дисперсии на стерильный бумажный диск размером шесть на один миллиметр. Нанесите дистиллированную воду на другой стерильный бумажный диск в качестве контроля. Высушите и простерилизуйте оба диска в вакуумной камере под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.

Затем поместите серебряный образец MWCNT и контрольную часть на агар и инкубируйте агаровую пластину при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов. По окончании измерьте зону торможения вокруг серебряного образца MWCNT. Перед испытанием автоклав трижды дистиллировали воду при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут.

Приготовьте дисперсию 1000 микрограмм на миллилитр функционализированных ЖМТ карбоновой кислоты и 50 мкг на миллилитр, 40 мкг на миллилитр и 30 мкг на миллилитр серебряных МВКНТ в этой стерильной воде. Чтобы начать процедуру антибактериального тестирования, подготовьте культуру метилобактерий, как описано выше, и контролируйте ее оптическую плотность на расстоянии 600 нанометров. Когда оптическая плотность достигнет максимума, внесите 100 микролитров культуры метилобактерий в три миллилитра свежей питательной среды R2A.

Поместите по 500 микролитров этого раствора в каждую из пяти 15-миллилитровых конических пробирок. Добавьте 100 микролитров метанола в одну из пробирок для подготовки эталонного образца метанола. Таким же образом подготовьте образец для каждой из четырех дисперсий.

Инкубируйте образцы и оставшуюся контрольную культуру метилобактерий при 180 об/мин и 30 градусах Цельсия до тех пор, пока оптическая плотность контроля не покажет максимальную активность. Используйте стерилизованный разбрасыватель для нанесения каждого образца на твердый агаровый гель R2A в чашках Петри. Выдерживайте посуду при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Подсчитайте образовавшиеся колонии бактерий и определите минимальную бактериоцидную концентрацию. Серебряные MWCNT были успешно синтезированы с использованием описанной процедуры. Средний размер осажденных частиц серебра составлял примерно 3,83 нанометра.

Рост метилобактерий не наблюдался при культивировании с дисперсиями серебра 50 мкг на миллилитр или 40 мкг на миллилитр. Популяция бактерий была уменьшена в 100 000 раз по сравнению с контрольным образцом при культивировании с дисперсией серебра MWCNT в концентрации 30 мкг на миллилитр. Зона ингибирования наблюдалась вокруг образца, полученного из дисперсии серебра MWCNT с концентрацией 10 микрограммов на миллилитр.

Зона торможения не наблюдалась для образца, приготовленного из дисперсии один микрограмм на миллилитр. Некоторая цитотоксичность наблюдалась при добавлении дисперсии серебра в концентрации 40 мкг на миллилитр. При добавлении дисперсии 30 мкг на миллилитр не наблюдалось существенной цитотоксичности.

Анализ трипанового синего подтвердил минимальную цитотоксичность при добавлении дисперсии серебра в 30 микрограммов на миллилитр. Этот протокол поможет исследователям в создании нанокомплексов, содержащих наночастицы металлов, которые действуют непосредственно на углеродные наноматериалы. Следуя этому протоколу, исследователи также смогут оценить антибактериальные свойства приготовленных нанокомплексов.