Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности

Общая цель этого экспериментального метода состоит в том, чтобы проверить роль многокопийных плазмид в эволюции устойчивости к антибиотикам. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как роль многокопийных плазмид в эволюции бактериальных инноваций. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он требует только базовых методов молекулярной биологии и простого плана эксперимента.

Это действительно круто. Во-первых, сконструируйте штамм кишечной палочки MG1655, который будет нести ген устойчивости к антителам в хромосоме лямбда-фага в уравнении на стороне ATTB. Для этого с помощью ПЦР амплифицируют области паралонга с 500 основаниями по обе стороны от сайта ATTB.

Затем с помощью ПЦР амплифицируют ген устойчивости к антибиотикам. Затем используйте изотермическую сборку при температуре 50 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы соединить области гомологии с продуктом ПЦР. После изотермической сборки переведите один микролитр продукта в 40 микролитров электрокомпетентных ячеек MG1655 в двухмиллиметровую кювету.

Затем электропорируют элементы при температуре 4 градуса Цельсия и 2,5 киловольта. После электропорации перенесите клетки в один миллилитр LB бульона с 0,2%-ной арабинозой. Затем пипеткой бульон, содержащий клетки, пипеткой можно в микрофуговую пробирку.

Интенсивно встряхивайте тюбик в течение двух часов при температуре 30 градусов Цельсия. Через два часа нанесите 100 микролитров культуры на агаровую пластину LB, дополненную антибиотиками. Затем раскрутите вниз оставшиеся ячейки.

И повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах свежего ЛБ бульона. Переложите эти элементы на другую агаровую пластину LB. Затем инкубируйте пластины при температуре 42 градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день с помощью ПЦР амплифицируют клоны для верификации конструкции с использованием внешних праймеров ybhC extern и ybhB extern. Затем подтвердите размер ампликона с помощью электрофореза в агарозной оболочке. Параллельно проведите секвенирование ДНК для проверки последовательности вставленного гена.

Чтобы сконструировать штамм, несущий ген устойчивости к антителам в мультикопийной плазмиде, сначала с помощью ПЦР амплифицируют ген устойчивости к антибиотикам blaTEM-1. После завершения ПЦР фосфорилировать амплифицированный продукт с помощью полинуклеотидкиназы Т4. Затем используйте высокоточную полимеразу и олигонуклеотиды PBAD FINV и PBAD RINV для ПЦР-амплификации плазмидного скелета PBAD.

Затем лигируйте два фрагмента ПЦР с помощью Т4-лигазы. Далее электропорируют 40 микролитров DH5 альфа-клеток с 1 микролитром продукта лигирования. Затем выберите подходящий антибиотик для гена устойчивости к антибиотикам и плазмидного остова на агаровых пластинах.

Затем выполните экстракцию плазмид с помощью набора для экстракции ДНК, следуя инструкциям производителя. Затем проведите секвенирование по Сэнгеру интересующего гена устойчивости, чтобы подтвердить отсутствие каких-либо возможных мутаций перед эволюционными экспериментами. После проверки последовательности электропорировать плазмиду в штамме кишечной палочки MG1655, чтобы в конечном итоге получить плазмиду, несущую штамм MG1655.

Наиболее важными шагами в этом протоколе являются построение модельных систем штаммов и реконструкция мутаций, наблюдаемых в ходе экспериментальной эволюции. Сначала нанесите интересующие штаммы MG1655 на агаровые пластины LB. Затем добавьте по 200 микролитров среды LB в каждую лунку 96-луночного планшета.

Далее инокулируют 48 изолированных колоний каждого штамма в отдельные лунки планшета. После инокуляции инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту. Опять же, инокулируйте два микролитра культуры из каждой лунки с популяцией основателя в новую 96-луночную пластину с 198 микролитрами среды LB в отдельных лунках.

Это положит начало эволюционному спасательному эксперименту. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 20 часов. Каждый день удваивайте концентрацию антибиотика по сравнению с предыдущим днем.

На следующий день переложите 2 микролитра соответствующей культуры в свежую 96-луночную тарелку и продолжайте так каждый день. Запишите показания оптической плотности на расстоянии 600 нанометров от отдельных лунок на планшетный считыватель. Важнейшим этапом протокола является экспериментальная эволюция и увеличение концентрации антибиотиков.

Скорость изменения концентраций антибиотиков является одним из параметров, которые могут быть изменены для стимулирования эволюции устойчивости к антибиотикам. Снова инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение 20 часов. Затем ежедневно измеряйте показания оптической плотности на расстоянии 600 нанометров для каждой выжившей популяции на считывателе пластин.

Замораживайте популяции периодически, каждые три-пять дней. Извлеките всю ДНК из эволюционировавших популяций и клонов из различных штаммов и методов лечения. Затем измерьте коэффициенты поглощения на 260:280 и 260:230 нанометрах на спектрофотометре, чтобы определить качество ДНК.

Затем используйте флуоресцентный краситель, связывающий ДНК, и подтвердите концентрацию ДНК, измерив флуоресценцию на планшетном считывателе. Кроме того, подвергните ДНК электрофорезу в агарозном геле, чтобы подтвердить, что нет деградации ДНК или загрязнения РНК. Затем проводят глубокое секвенирование ДНК с образцами, полученными от целых популяций и отдельных клонов, чтобы изучить генетическую основу устойчивости к антибиотикам.

Данное исследование является примером возможных результатов экспериментальной системы с использованием трех штаммов кишечной палочки. Этими штаммами являются кишечная палочка MG1655, MG1655, несущая ген резистентности в хромосоме MG1655 resA, и MG1655, несущая ген резистентности в мультикопируемой плазмиде MG1655 pRESA. В качестве антибиотиков используются цефтазидим и меропенем.

На этой левой панели показаны кривые выживаемости при возрастающих концентрациях цефтазидима. Из графика видно, что подпопуляция штамма MG1655 pRESA способна расти более 14 дней даже после удвоения концентрации цефтазидима каждый день. Напротив, другие штаммы не выживают дольше 8 дней при воздействии аналогичных концентраций цефтазидима.

Тем не менее, те же штаммы не показывают существенных различий в периоде выживаемости при воздействии аналогичной концентрации другого антибиотика, меропенема. Все три штамма выживают только от 6 до 8 дней при воздействии меропенема. Это указывает на то, что присутствие гена resA в многокопийной плазмиде потенцирует эволюцию резистентности к цефтазидиму, но не к меропенему.

После освоения полного протокола эксперимента он может быть выполнен в течение нескольких недель, если все сделано правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать роль многокопийных плазмид в эволюции инноваций у бактерий.