Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Общая цель этого метода заключается в маркировке и визуализации живых хромосом в митотических клетках с помощью метки Histone 2B-GFP BacMam 2.0 и системы конфокальной микроскопии с вращающимся диском. Этот метод может быть использован для визуализации митотических хромосом в культивируемых клетках для изучения влияния генетических модификаций или медикаментозного лечения на сегрегацию хромосом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой и удобный метод маркировки и визуализации живых хромосом в митотических клетках.

Процедуру визуализации в реальном времени будет демонстрировать доктор Кадзуё Такеда, который обслуживает основное подразделение микроскопии и визуализации в отделе вирусных продуктов Центра оценки и исследований биологических препаратов FDA. Эмбриональные фибробласты мыши, или MEF, используемые в этом эксперименте, выращиваются в двухкамерном защитном стекле при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение ночи, как описано в текстовом протоколе. На следующий день синхронизируйте MEF в фазе G0/G1 путем инкубации в питательной среде DMEM/F12, содержащей 0,1% FBS.

В день маркировки приготовьте 1,5 миллиграмм на миллилитр стокового раствора нокодазола в ДМСО. Важным шагом является расчет правильного количества частиц CL-HB в клетках, чтобы достичь достаточного количества мечения для визуализации хромосом без токсичности для клеток. Ранее с помощью экспериментов с титрованием мы определили, что 30 PPC работает лучше всего.

Добавьте к МЭФ 200 микролитров питательной среды с 10% FCS, 200 нанограмм на миллилитр нокодазола и реагент CL-HB в концентрации 30 частиц на клетки. Инкубируйте MEF при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 18 часов. Визуализация MEF осуществляется с помощью системы конфокального микроскопа с вращающимся диском, оснащенной климатической камерой и объективом с 63-кратным увеличением и масляной иммерсией.

За день до получения изображения включите климатическую камеру и прогрейте всю камеру до 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день включите питание подставки для микроскопа, камеры, вращающегося диска, осветителя, аргонового лазера, компьютера и моторизованного предметного столика. Дав системе прогреться в течение трех минут, запустите аргоновый лазер, включив ключ зажигания.

Переключите тумблер аргонового лазера из режима ожидания в режим работы лазера. Запустите программное обеспечение для сбора и обработки данных. Запустите контроллер CO2 для инкубатора на сцене и установите концентрацию CO2 на уровне 5%.Снимите камерное защитное стекло с инкубатора, поместите его на столик микроскопа и выберите объектив с масляным погружением 63X.

Смотрите через окулярные линзы, фокусируйте изображение и идентифицируйте клетку в стадии разрушения ядерной оболочки или NEBD. Используйте аргоновый лазер с углом погружения 488 нанометров для визуализации гистона 2B-GFP. Откройте окно управления захватом и установите время экспозиции для канала GFP.

Определите клетку, которая находится в NEBD. Затем вручную определите верхнюю и нижнюю фокальную плоскость ячейки и войдите в настройки оптического сечения XYZ. Наблюдайте за клеткой в течение 20 минут.

Важно знать, что, поскольку не все клетки проходят через митоз, необходимо активно контролировать прогресс митоза. Если клетка не продолжает деление в течение 20 минут, остановите получение изображения и перейдите к следующей клетке, которая находится в NEBD. Чтобы получить данные для фильма, делайте снимки каждые три минуты.

Примерно один час на клетку требуется для визуализации запаздывающих хромосом во время митоза в клетках PP2A-B56-гамма, которые вырвались из контрольной точки сборки веретена. Сохраняйте изображения в формате ZVI для дальнейшего анализа. Визуализация живых клеток использовалась для визуализации судьбы отдельных клеток по мере их продвижения от NEBD через митоз.

После лечения нокодазолом все 21 наблюдаемые клетки дикого типа были остановлены в метафазе. Напротив, из 21 клетки, в которых отсутствовал PP2A-B56-гамма, 16 смогли пройти через митоз после лечения нокодазолом. Кроме того, аномальная хромосомная сегрегация была обнаружена в 13 из этих MEF.

В этом видеоклипе показан пример клетки PP2A-B56-гамма, подвергшейся хромосомной неправильной сегрегации. После освоения этой техники потребуется от трех до четырех дней в зависимости от обработки клеток до протокола мечения. Важно помнить, что это транзиторная трансфекция и сигналы могут быть обнаружены только до пяти дней.

Этот протокол может быть использован для ответа на дополнительные вопросы, связанные с регуляцией клеточного цикла, геномной нестабильностью и качеством продуктов клеточной терапии. После его разработки этот метод может быть использован для изучения визуализации хромосом в реальном времени в самых разных клеточных линиях, таких как первичные клеточные линии, стволовые клетки, нейроны и иммортализированные Т-клетки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как легко маркировать и визуализировать живые хромосомы в митотических клетках с помощью метки Histone 2B-GFP BacMam 2 и системы конфокальной микроскопии с вращающимся диском.