Оптимизация использования жидкого обработки робот провести высокой пропускной способности вперед химических генетики экран Arabidopsis thaliana

Общая цель этого протокола заключается в проведении высокопроизводительного динамического химического генетического скрининга на рассаде арабидопсиса. С помощью этого метода мы можем эффективно и результативно открывать новые малые молекулы, влияющие на физиологию растений. Эти открытия послужат основой для дальнейших исследований физиологических процессов, таких как синтез клеточной стенки.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что за короткий промежуток времени можно провести скрининг десятков тысяч малых молекул. Хотя этот протокол разработан для модельного вида растений Arabidopsis, он может быть легко адаптирован к другим организмам, таким как насекомые, микроорганизмы или клеточные культуры. Идея этого протокола пришла нам в голову, когда мы узнали, что университетскому геномному центру необходимо найти дом для робота, работающего с излишками жидкости.

Мы сразу же вызвались снять его у них с рук. Подготовьте библиотеку разбавления и многоканальный автоматизированный позиционер лабораторного оборудования Tip Wash или ALP, как описано в текстовом протоколе. Вручную загрузите Stacker 10s, прикрепленный к карусели штабелера.

В отелях с A по D сначала загрузите одну коробку наконечников для дозатора AP96 P20 в первую комнату. Затем загрузите четыре 96-луночные пластины с V-образным дном в залы со второй по пятую с двумя верхними пластинами, содержащими исходные концентрации из заказанной библиотеки, и двумя другими нижними пластинами, пустыми. Кроме того, загрузите одну коробку наконечников для дозатора AP96 P20 в шестой комнате.

Загрузите четыре 96-луночные пластины с V-образным дном в залы с седьмого по девятый, причем две верхние пластины содержали складские концентрации заказанной библиотеки, а две нижние пластины были пустыми. Установите деку с 300 миллилитровыми водами в резервуаре на P3, 300-миллилитровой ванной с 70% этанолом на P7, Tip Loader ALP и многоканальным Tip Wash ALP. С помощью программного обеспечения робота для работы с жидкостями предъявите наконечники для дозаторов AP96 P20 из Stacker 10 и переместите их в загрузчик наконечников ALP.

Разместите номер два от отеля А и отделите все четыре 96-луночные V-образные пластины на палубе, разместив две нижние пластины на P4 и P8, а две верхние на P5 и P9. Загрузите наконечники для дозатора AP96 P20 с помощью загрузчика наконечников ALP на 96-канальную головку объемом 200 микролитров. Отасуньте 90 микролитров из резервуара для воды объемом 300 миллилитров и распределите в 96-луночную V-образную разбавляющую пластину на P4. Повторите шаг для пластины на P8. Смешайте химическую библиотечную пластину на P5, многократно отсасывая и дозируя 15 микролитров три раза. Кроме того, аспирируйте 10 микролитров из планшета химической библиотеки на P5 и диспенсируйте 10 микролитров в разбавляющий планшет на P4. Смешайте растворы планшета на P4, многократно отсасывая и дозируя 50 микролитров в общей сложности три раза.

После смешивания очистите наконечники пипеток AP96 P20, отасунув и дозировав 70 микролитров 70% этанола из P7, затем промойте их в многоканальной промывке наконечников ALP, отасунув и дозировав 110% объем воды четыре раза. Повторите эти действия для второй пары пластин на P8 и P9. После создания второй 96-луночной V-образной пластины для разбавления уложите пластины P9, P5, P8 и P4 в указанном порядке снизу вверх. Затем поместите стек на одну пустую статическую ALP.

Используйте P1, P2, P6, P10, P11, P12 или P13. Повторяйте эти действия до тех пор, пока номер пять в отеле А не опустеет, затем, дойдя до номера номер шесть, начните процесс снова, переместив новые наконечники для дозаторов AP96 P20 в загрузчик наконечников ALP и поместив использованные наконечники для дозаторов AP96 P20 на пустой статический наконечник для дозаторов. Повторяйте процедуру до тех пор, пока номер 9 отеля А не опустеет.

Чтобы добраться до отеля B, пластины и наконечники на палубе должны быть загружены в отель A. Хотя робот может работать без присмотра, необходимо наполнять резервуар для воды после каждого цикла разбавления. Если цикл возобновится с недостаточным количеством воды, робот будет всасывать воздух, и химикаты не будут разбавлены. Вручную наполните 300-миллилитровый резервуар для воды.

Компьютерная программа может включать паузу с подробным описанием этого сообщения, требуя от пользователя нажать кнопку «Продолжить» перед выполнением следующего шага. Повторите шаги разбавления для оставшихся трех отелей. Вручную добавляем семена в среду плотностью 0,1 грамма на 100 миллилитров.

Такая плотность дает в среднем 3-10 семян на лунку 96-луночного планшета. Вручную поместите четыре 96-луночные пластины с плоским дном в номера 1 и 2 отеля A. Поместите коробку с наконечниками для пипеток AP96 P250 на загрузчик наконечников ALP, резервуар объемом 300 миллилитров, заполненный смесью среды и семян, на P3 и резервуар объемом 300 миллилитров, заполненный 70% этанолом, на P7. Используя операционное программное обеспечение, представьте номера 1 и 2 в отеле А и разделите стопки из четырех тарелок. Поместите по одной пластине на каждый из пустых статических ALP, затем загрузите наконечники для дозатора AP96 P250 на 96-канальную головку объемом 200 микролитров.

Отсадите 90 микролитров из 300-миллилитрового резервуара для затравок на P3 и распределите его в первую 96-луночную плоскую донную пластину. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все восемь пластин не будут содержать смесь среды и семян. Очистите наконечники пипеток AP96 P250, отсасывая и дозируя 70 микролитров из 300-миллилитрового резервуара, заполненного 70% этанолом на P7. Промойте наконечники в многоканальном аппарате для промывки наконечников ALP, четыре раза отасунув и дозировав 110% объема воды, затем выгрузите наконечники в TL1.

Наконец, соберите тарелки вручную. Вручную загрузите коробку с наконечниками для дозатора AP96 P250 в первую комнату отеля A. Кроме того, загрузите две 96-луночные библиотечные пластины для разбавления V-образным дном во вторую, четвертую, шестую и восьмую комнаты. Загрузите две 96-луночные просеивающие пластины с плоским дном в третью, пятую, седьмую и девятую камеры.

С помощью операционного программного обеспечения настройте деку так, чтобы она содержала промывочный резервуар объемом 300 миллилитров 70% этанола в точке P7. Резервуар для засева можно оставить на палубе в точке P3. Дополнительно включите привод консоли через подключение контроллера устройства для циркуляции воды через многоканальный наконечник Wash ALP. Это автоматически выключится по окончании протокола. Подарите коробку с наконечником для дозатора AP96 P250 из отеля A и переместите ее в загрузчик наконечников ALP.

Затем поднесите на палубу 96-луночные таблицы с V-образным дном из второго зала отеля А. Поместите одну пластину на статическую пластину ALP P4 и одну пластину на P8. Затем подайте 96-луночные просеивающие пластины с плоским дном из третьего зала отеля А на палубу. Поместите одну пластину на статическую пластину ALP P5 и одну на P9. Загрузите наконечники для дозатора AP96 P250 с помощью загрузчика наконечников ALP на 96-канальную головку объемом 200 микролитров.

Смешайте 96-луночную пластину для разбавления с V-образным дном на P4, отасунув и дозировав 50 микролитров три раза. После этого отасуньте 10 микролитров из этой пластины и распределите в 96-луночный просеивающий планшет с плоским дном на P5. Смешайте растворы в тарелке на уровне P5, отсасывая и дозируя 50 микролитров три раза. Очистите наконечники пипеток AP96 P250 этанолом, отасунув и выдав 70 микролитров 70%-ного этанола из резервуара с температурой P7. Затем промойте наконечники в многоканальном принтере Tip Wash ALP, отасунув и дозировав 110% объем воды четыре раза.

Повторите эти действия для второй 96-луночной библиотеки разбавления V-образным дном и 96-луночной просеивающей пластины с плоским дном. Сложите две 96-луночные библиотечные пластины для разбавления V-образным дном вместе и две 96-луночные просеивающие пластины с плоским дном. Переместите пластины в неподвижные ЩП.

Затем повторите процесс три раза, добавив разбавленные химикаты в просеивающие пластины в общей сложности восемь раз. Наконец, проверьте количество семян в каждой лунке просеивающих пластин с помощью визуального подтверждения. Дополните лунки менее чем тремя семенами, добавив стерилизованные и яровизированные семена.

Критически важно следить за тем, чтобы среда, в которой выращивается рассада, не пересыхала, так как это приведет к плохой всхожести. Тарелки с рассадой следует хранить при высокой влажности воздуха или в контейнерах, устойчивых к высыханию. Инкубируйте 96-луночные просеивающие планшеты с плоским дном в течение четырех дней в климатической камере при температуре 22 градуса Цельсия по циклу 16/8 свет/темнота в контейнере, устойчивом к высыханию.

Визуализируйте 96-луночные экранирующие планшеты с плоским дном под препарирующим микроскопом и запишите все аберрантные фенотипы для дальнейшего исследования. Примерами нормальных и аберрантных фенотипов являются отсутствие видимых морфологических аномалий, коричневые корневые волоски, чахлые корни, сильно отстающие в росте корни, обесцвеченные, зеленые слизи, неполное прорастание и отсутствие прорастания. Видимые фенотипы в процентном соотношении отображаются в виде круговой диаграммы.

У сеянцев наблюдались аномалии в морфологии корней, пигментации, корневых волосках и прорастании. Также сюда входит множество других, которые включают в себя производство зеленой слизи. После освоения этот метод может значительно повысить эффективность и точность больших прямых химико-генетических скринингов.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о стерилизации и яровизации семян, пополнении резервуара для воды на этапах разбавления, обеспечении хранения образцов в контейнерах, устойчивых к высыханию, и о том, что вся визуализация выполняется в планшетах с плоским дном. В зависимости от физиологического процесса, который вы хотите исследовать, этот первоначальный скрининг может сопровождаться дополнительными анализами, которые помогут определить механизм действия каждого химического вещества. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать робота для работы с жидкостями для повышения эффективности и точности химико-генетического скрининга.