Пункция индуцированной неоваскуляризации Iris как модель мыши Рубеоз Радужки

Общая цель этой процедуры заключается в индуцировании сосудистой оболочки глаза, что позволяет напрямую визуализировать ангиогенные процессы in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, в частности при неоваскулярных заболеваниях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что в нем используются мыши-альбиноса, что позволяет визуализировать кровеносные сосуды в прямом эфире.

Благодаря этому методу можно дать представление о глазных неоваскулярных заболеваниях. Он также может быть применен в качестве общей модели ангиогенеза, например, для тестирования новых ангиогенных методов лечения. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как рассечение радужной оболочки является сложной задачей из-за небольшого размера мышиного глаза.

Однако с практикой его можно освоить. После обезболивания мыши P12.5 и подготовки ее к процедуре поместите ее в боковое лежачее положение под стереоскопом и убедитесь, что маска расположена правильно. Глаз должен заполнять поле зрения.

Четкая фокусировка взгляда является обязательным условием. Далее, с помощью небольших связывающих щипцов в недоминантной руке, осторожно выпячивайте глаз, надавливая вниз на веки, тыльной и вентральной к глазу. Помогает крепкая фиксация века.

Прежде чем продолжить, сфотографируйте сосудистую сеть при 40X. Затем с помощью стереоскопа определите местоположение лимба роговицы. Лимб мышей-альбиносов BALB/c можно легко идентифицировать как кольцевое сосудистое сплетение, расположенное позади роговицы.

Теперь в доминирующей руке держите скошенную иглу 30 калибра и с ее помощью выполните небольшой увеальный прокол возле задней лимбальной границы увеа между цилиарным телом и ora serrata. Делайте прокол, используя только кончик иглы и не более половины скоса. Избегайте разрыва хрусталика.

Прокол должен быть самогермазирующимся, но при этом позволять внутриглазное введение исследуемых веществ через рану. Далее выполните повторную увеальную прокол в противоположном участке глаза. Оптимизируйте проколы так, чтобы они находились в наиболее дорсальном и наиболее вентральном положениях.

Повторяйте увеальные проколы в тех же двух положениях каждые четыре дня до P24.5. А перед повторением пункции всегда проверяйте наличие травматической катаракты. После энуклеации глаза и его фиксации, как описано в текстовом протоколе, удалите фиксирующий раствор и трижды промойте глаз свежим PBS.

Затем поместите глаз на гладкую сухую поверхность передней камерой вверх. Затем вставьте скошенную иглу 30 калибра сзади к лимбусу, чтобы сделать точку входа. Затем закрепите передний сегмент небольшими щипцами для связывания и с помощью прямых ножниц Clayman-Vannas разрежьте вокруг лимба, вращая глаз.

Использование частичных разрезов может облегчить процесс. Когда это будет завершено, задний отрезок глаза должен освободиться. Затем расположите передний сегмент вниз, чтобы обнажить хрусталик.

Снимите линзу осторожно, захватив ее небольшими щипцами и потянув вверх. Теперь расположите передний сегмент роговицей вниз и разрезом перпендикулярно полю зрения. Затем аккуратно захватите ткань позади цилиарного тела с помощью небольших связывающих щипцов в недоминантной руке.

Клеймен-Ваннас прямые ножницы для обрезки прямо перед цилиарным телом с целью удаления трабекулярной сетки и изоляции радужной оболочки. Затем радужная оболочка должна перемещаться внутри роговицы. Затем с помощью небольших завязывающих щипцов захватите роговицу и осторожно перенесите переднюю наглазницу на 96-луночную пластину, содержащую 200 микролитров PBS.

Сохраняйте захват роговицы и продолжайте рассекать радужную оболочку, промывая ткань PBS. При необходимости можно использовать иглу 30 калибра, чтобы помочь сместить радужную оболочку. Теперь удалите роговицу с помощью небольших щипцов для связывания.

Затем изолированная радужная оболочка может храниться в PBS при температуре четыре градуса Цельсия временно до тех пор, пока на ней не будут проведены эксперименты. Мышей-альбиносов BALB/c в P12.5 подвергали увеальным пункциям, повторяемым каждый четвертый день до P24.5, как описано. Из-за прозрачности роговицы и дефицита меланина у мышей BALB/c, сосудистая сеть радужки хорошо видна у щенков P16.5 и усиливается на протяжении всего протокола.

В P27.5 мышей усыпляли, а их радужные оболочки тщательно препарировали. Проколы вызывали сосудистую реакцию радужной оболочки, запуская систему заживления ран. Иммуногистохимический анализ проводили в отношении PECAM1.

Полученное окрашивание показало увеличение общей сосудистой сети в радужной оболочке проколотых глаз по сравнению с контрольной группой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как индуцировать ангиогенез радужной оболочки глаза и успешно изолировать радужную оболочку мыши. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как QBCR, чтобы ответить на дополнительные молекулярные и клеточные вопросы, такие как проверка эффективности проангиогенных или антиангиогенных веществ.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению неоваскулярных заболеваний неинвазивными методами in vivo с использованием небольших грызунов в качестве модели.