Microarray Assay протеина для серологических определения антиген специфические антитела ответы следующие Clostridium difficile инфекции

Этот метод может помочь в оптимизации и выборе клинически полезных иммунотерапевтических препаратов для лечения инфекции Clostridium difficile с учетом специфики пациента, а также в выяснении иммунных реакций человека на Clostridium difficile. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет точно и одновременно количественно определять мультиизотипические и штамм-специфические ответы антител на антигены C.difficile. Как правило, люди, которые являются новичками в этом методе, будут испытывать трудности, потому что требуется опыт для создания и оптимизации панели высокоочищенных антигенов, а также для создания технологической платформы.

Наглядная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как типы методических перечней, связанные с подготовкой микроволновой пластины, печатью матриц, безопасной процедурой и анализом данных, требуют внимания к деталям. Некоторые из этих процедур будут продемонстрированы Сэмом Гринвудом, техником из моей лаборатории. Для начала разбавьте антигены Clostridium difficile и печатный буфер до оптимальной концентрации.

Далее перелейте 10 микролитров раствора антигена в 384 луночный планшет. Накройте пластину пломбой и центрифугируйте при 300-кратной гравитации в течение пяти минут при комнатной температуре. Для печати на микрочипах используйте ручную газовую горелку, чтобы нагреть кремниевый контакт три раза по две секунды каждый.

Затем промойте силиконовый PIN-код в чистой воде три раза по три секунды каждый. Поместите пластину микрочипа в загрузочный картридж массива. Извлеките лоток, а затем поместите предметные стекла с аминосиланом в лоток и нажмите кнопку OK, чтобы включить пылесос.

Убедитесь, что все слайды закреплены, а затем нажмите кнопку «ОК». Верните противень в исходное положение и закройте крышку. Далее запускаем соответствующую программу и переходим в Файл, затем Параметры микромассива, затем Открыть. Выберите файл Clostridium difficile для печати всех антигенов в четверном виде.

В этом окне откройте вкладку «Источник», чтобы указать хранение образца, и вкладку «Цель», чтобы ввести сведения о микрочипе. Затем откройте вкладку «Параметры», чтобы выбрать инструмент для стирки. На вкладке «Общие» в разделе «Настройки выполнения» на панели инструментов набора приложений TAS выберите «Промывка в начале выполнения» и «Промывка в конце выполнения».

Откройте вкладку «Климат» и установите уровень влажности в диапазоне от 55 до 60%Теперь запустите работу и периодически проверяйте массив, чтобы убедиться в его правильной работе. После печати аккуратно поместите напечатанные слайды в держатель слайдов с 16 многолуночными камерами. Затем добавьте 100 микролитров 5%BSAT в каждый блок.

Накрыть горки крышками и выдерживать в течение часа при комнатной температуре с встряхиванием. Используйте 120 микролитров PBST для промывания каждого блока пять раз по одной минуте каждый с встряхиванием. Затем разморозьте образцы сыворотки, полученные от инфицированных C. difficile, и здоровых контрольных групп на льду в течение 20 минут.

Добавьте коммерчески доступный разбавитель антител в мастер-блок, а затем добавьте образцы в мастер-блок и перемешайте. Выбросьте промывочный буфер и добавьте по 100 микролитров каждого разведенного образца в экспериментальные блоки. Для блока отрицательного контроля добавьте 100 микролитров только разбавителя антител.

Затем выдержите предметные стекла в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Затем используйте 120 микролитров PBST для промывки каждого блока пять раз по три минуты каждый с встряхиванием. Затем добавьте в каждый блок по 100 микролитров биотинилированных козьих антител к человеку, разведенных в разбавителе антител.

Накройте предметные стекла крышкой и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Используйте 120 микролитров PBST для промывки каждого блока пять раз по три минуты каждый с встряхиванием. Далее добавьте 100 микролитров конъюгата стрептавидина SY5, разведенного в 5% BSAT, в соотношении от одной до двух тысяч на каждый блок.

Накройте горки пленкой и выдерживайте 15 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием. Сначала промойте слайды 120 микролитрами PBST пять раз по одной минуте каждый, а затем промойте их еще два раза по одной минуте каждый с PBS. Чтобы высушить слайды, вращайте их в течение пяти минут со скоростью, в 300 раз превышающей силу тяжести.

Включите лазерный сканер за 30 минут до сканирования, чтобы он нагрелся. Затем поместите предметное стекло в сканер отпечатанной поверхностью вверх до тех пор, пока индикатор пластины не станет постоянно зеленым. Далее нажмите кнопку «Настройки».

На первой вкладке убедитесь, что флажки Автоматическая прокрутка и Штрихкод сняты. Затем установите размер пикселя на 10, Режим сканирования на Средний, Сбор данных на Только 635, Режим сбора на Вручную, Усиление на 20 и Низкое энергопотребление. На второй вкладке убедитесь, что тип слайда не помечен.

На третьей вкладке установите для параметра Фокус значение Автофокус. Нажмите кнопку импорта сетки, чтобы выбрать соответствующий список массивов, связанный со сканированным изображением. Затем нажмите кнопку автопоиска, чтобы выровнять сетку по местам на слайде.

Наконец, нажмите кнопку «Процесс количественной оценки», чтобы измерить интенсивность флуоресценции каждого пятна. Затем сохраните результаты в подходящем формате для дальнейшего анализа. В этом протоколе белковый микрочип сравнивается с методом ИФА для оценки воспроизводимости между этими двумя методами.

Анализ коэффициента корреляции Спирмена показывает значительное совпадение между микрочипом и ИФА для обнаружения уровней антитоксина А IgG и антитоксина В в образцах сыворотки. Вводный анализ и межпрозрачная воспроизводимость белкового микрочипа рассчитаны с использованием образцов сыворотки крови семи пациентов. Образцы, проанализированные на двух разных предметных стеклах на предметных стеклах на отношении токсина А, токсина В, SLP001, SLP002, SLP027, токсина В из токсина В, продуцирующего только штамм CCUG, и антигенов pCDTb, показали хорошую воспроизводимость.

Белковый микрочип проводится для обнаружения изотип-специфического ответа антител против токсинов Clostridium difficile. Образцы сыворотки крови пациентов и здоровых лиц используются для определения уровней IgG и IgA в отношении токсина А, токсина В, токсина В только экспрессирующего штамма токсина Clostridium difficile и прекурсора фрагмента В-бинарного токсина. После освоения этой техники ее можно сделать за семь часов.

Эксперимент по контролю качества, различные параметры, такие как выбор подходящей химии поверхности, печать буферов, блокирующие буферы, а также разведения образцов сыворотки и вторичных антител, должны быть оценены перед запуском образцов. Печать высококачественного массива требует хорошего понимания массива или программного обеспечения для настройки печати параметров в соответствии с протоколом эксперимента. Крайне важно поддерживать оптимальную производительность массива и отсутствие пыли на протяжении всего эксперимента.

Этот метод проложит путь для исследователей в области иммунологии и молекулярной биологии с точки зрения характеристики гуморальных иммунных реакций на инфекцию и открытия серодиагностических антигенов. Не забывайте, что работа с инфицированными образцами крови и бактериальными токсинами может быть опасной. В целом, в лаборатории при выполнении этой процедуры всегда следует учитывать технику безопасности и стандартные меры предосторожности.