Изоляция эндотелиальных клеток человека от обычной толстой кишки и колоректальный рак - улучшение протокол

Общей целью этого протокола выделения клеток является получение чистых и жизнеспособных эндотелиальных клеток у пациентов, страдающих колоректальной карциномой, как из опухоли, так и из соответствующей нормальной толстой кишки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии опухолей и ангиогенеза, такие как оценка и анализ влияния системы кровеносных сосудов на колоректальный опухолегенез. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно иметь относительно высокий уровень успеха в получении чистых и жизнеспособных эндотелиальных клеток человека от пациентов с колоректальной карциномой.

Чтобы получить образец ткани у пациентов с колоректальной карциномой, используйте свежий скальпель для получения кусочков ткани весом около грамма. Затем с помощью стерильных щипцов перенесите кусочки свежей ткани в 40 миллилитрах ледяного буфера HBSS с антибиотиками в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Затем с помощью отдельных стерильных щипцов последовательно перенесите карциному и нормальную ткань из одной центрифужной пробирки в другую, чтобы четыре раза промыть 40 миллилитров ледяного буфера HBSS с антибиотиками.

Чтобы удалить весь жир, неопухолевую ткань или потенциально некротические части ткани, используйте стерильные щипцы и перенесите кусочки ткани в стерильную клеточную культуру в чашку Петри. Затем добавьте от трех до пяти миллилитров буфера HBSS с добавлением антибиотиков, чтобы кусочки ткани увлажнились. Далее с помощью свежего скальпеля обрежьте кусочки ткани.

Затем с помощью скальпеля с изогнутым лезвием измельчите оставшуюся ткань на мелкие кусочки. Переложите кусочки измельченной ткани в пробирку для диссоциации тканей, заполненную предварительно подогретой средой для клеточной культуры. Диссоциируйте кусочки измельченной ткани с помощью диссоциатора тканей вместе с набором для диссоциации опухоли для тканей человека, следуя инструкциям производителя.

Первым важным шагом является правильная обработка и микропрепарирование хирургического образца с целью получения фрагментов ткани нужного размера и типа ткани. После диссоциации кусочков ткани центрифугируйте ее при комнатной температуре при 300-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты. Затем с помощью серологической пипетки добавьте 10 миллилитров предварительно подогретой среды DMEM Low в пробирку MACS.

Затем вылейте клеточную суспензию из пробирки на клеточный фильтр с размером пор 100 микрометров, установленный поверх 50-миллилитровой центрифужной пробирки. Пипетируйте еще 10 миллилитров среды DMEM Low в пробирку MACS, чтобы промыть дополнительные ячейки из пробирки через сетчатый фильтр в центрифужной пробирке. После того, как вся клеточная суспензия будет профильтрована, промойте клеточное ситечко еще 10 миллилитрами среды DMEM Low.

Центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре при 300-кратном давлении в течение семи минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость после окончания центрифугирования. Затем растворите клеточную гранулу в пяти миллилитрах антибиотиков с добавленной, предварительно подогретой средой EBM-2-MV в той же 50-миллилитровой центрифужной пробирке.

Удалите защитный раствор из культуральной колбы и перенесите клеточную суспензию непосредственно в культуральную колбу Т-25, где температура составляет 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда слияние достигнет примерно 80-90%, добавьте один миллилитр Аккутазы, чтобы отделить клетки в колбе. Затем оставьте клетки с Аккутазой на 10 минут.

Далее добавьте в ячейки четыре миллилитра среды EBM-2-MV, поддерживаемой при температуре 37 градусов. Затем используйте автоматизированное устройство для подсчета клеток с диапазоном от 10 до 25 микрометров для подсчета клеток. Вторым по важности этапом являются все этапы, на которых ячейки должны быть разделены.

Оценка правильной точки времени требует опыта. Если расщепление произойдет слишком рано, клетки погибнут. Если расщепление происходит слишком поздно, эндотелиальные клетки достигнут старения или чрезмерный рост фибробластов станет проблемой.

Затем центрифугируйте клетки при комнатной температуре при 250-кратной скорости гравитации в течение четырех минут и изгоняйте надосадочную жидкость в конце прогона. Затем растворите клеточную гранулу в предварительно нагретом буфере FACS. Затем добавьте в клетки антитела, окрашивающие FACS.

Перемешайте и затем выдерживайте при комнатной температуре в общей сложности 15 минут. По прошествии половины этого инкубационного периода прокрутите трубку один раз. С помощью серологической пипетки добавьте два миллилитра буфера FACS в меченую клеточную суспензию.

Затем центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре при 250-кратном давлении в течение четырех минут и сцеживайте надосадочную жидкость после окончания центрифугирования. Затем добавьте два миллилитра буфера FACS, чтобы растворить клеточную гранулу, и центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение четырех минут при 250-кратной гравитации. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах среды EBM-2-MV с добавлением антибиотика.

Далее перенесите ячейки в инструмент сортировки FACS. Определите тройные положительные клетки и дайте им посеять семена в 24-луночной чашке для культивирования, заполненной свежей, предварительно подогретой средой EBM-2-MV. Культивируйте клетки в течение следующих 48 часов, а затем обновите среду.

Продолжайте менять среду каждые два дня, пока слияние не достигнет 90-100% через пять-10 дней. Затем расширьте популяцию клеток в соответствии с желаемой культурой в чашке. Затем, как только будет достигнуто слияние, соберите урожай и приступайте к характеризации.

Сначала полученный образец опухоли диссоциируют и засеивают в чашку для клеточной культуры. Неадгезивные клетки смывают, а адгезивные клетки культивируют до 80–90% конфлюенции перед сортировкой FACS. Затем проводится анализ FACS для идентификации популяции иммуномеченной жизнеспособной опухоли и нормальных эндотелиальных клеток.

Для этого проводится тройное мечение флуорохром-сопряженных антител нормальных и опухолевых эндотелиальных клеток, которое сортируется с помощью FACS. В среднем 3,6 и 5,6% от всей отсортированной клеточной популяции составляют опухолевые и нормальные эндотелиальные клетки соответственно. Далее для выявления экспрессии маркеров эндотелиальных клеток полученные нормальные и опухолевые эндотелиальные клетки подвергают иммуноцитохимии.

На изображениях здесь показаны CD31-положительные нормальные и опухолевые эндотелиальные клетки. Затем РНК выделяют из CD31-положительной популяции эндотелиальных клеток и подвергают ОТ-кПЦР для идентификации других маркеров, специфичных для эндотелиальных клеток. На графике также обнаружена экспрессия маркеров эндотелиальных клеток, таких как CD105, VE-кадгерин и фактор фон Виллебранда, но экспрессия маркеров потенциально контаминирующих клеточных популяций отсутствует, что указывает на чистоту выделенных эндотелиальных клеточных культур.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за три недели, если она выполнена правильно. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что он требует опыта работы с первичными культурами эндотелиальных клеток, чтобы оценить, когда и в каких соотношениях клетки могут быть разделены или подвергнуты дальнейшей обработке для анализа сортировки FACS. Применение этого метода распространяется и на терапию колоректальной карциномы, поскольку клеточные культуры могут быть использованы для идентификации механизмов реакции на лечение опухоли или резистентности при колоректальной карциноме.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы прочитали многочисленные сообщения в литературе, указывающие на проблемы с созданием действительно чистых и жизнеспособных эндотелиальных клеток из солидных опухолей человека. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы микродиссекции тканей или обработки для сортировки FACS, анализа или дальнейшего расщепления эндотелиальных клеток требуют опыта для того, чтобы правильно определить момент времени. При попытке проведения этой процедуры важно сначала установить функциональную сеть сотрудничества с хирургией, патологоанатомией и регистром опухолей.

Кроме того, вы должны быть обучены физическим упражнениям для работы с первичными культурами эндотелиальных клеток, так как эти клетки хрупкие. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить эндотелиальные клетки из колоректальной карциномы человека и соответствующей нормальной толстой кишки.