Пространственная количественного определения наркотиков в поражении туберкулезом легких лазером захватить Microdissection жидкость хроматографии масс-спектрометрия (LCM-LC/МС)
18 апреля 2018 г.
Здесь мы описываем протокол, с помощью лазерного захвата microdissection наряду с анализом LC/MS поддается пространственно-дистрибутивов наркотиков в течение туберкулеза гранулемы. Этот подход имеет широкую применимость для количественного определения концентрации препарата в тканях при высоких пространственных деталей.
Общая цель данного аналитического метода заключается в количественном определении противотуберкулезного препарата этамбутола в тканевых компартментах туберкулезного поражения легких, чтобы определить, достигаются ли концентрации бактерицидных препаратов. Этот метод может ответить на вопросы в области поиска и разработки лекарств от туберкулеза, определяя, достигают ли вводимые препараты популяций бактерий в стерилизующих концентрациях во всех тканевых компартментах гранулемы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить полную количественную оценку концентраций лекарственных препаратов с высокой пространственной детализацией в конкретных тканевых структурах и клеточных популяциях.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы разрезания тканей и монтажа трудно освоить из-за возможности загрязнения тканей и хрупкого характера предметных стекол мембраны. Начните эту процедуру с забора тканей, как описано в текстовом протоколе. Чтобы выполнить разрезание тканей, сначала установите криостат на нужную температуру резки.
Перенесите гамма-облученную биопсию легких из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия в криостат и оставьте на 30 минут для выравнивания температуры тканей. С помощью пинцета закрепите биопсию на патроне криостата, используя небольшое количество клея оптимальной температуры резки, чтобы приклеить основание ткани к патрону. Ориентируйте ткань так, чтобы плоская поверхность была открытой поверхностью для резки.
Убедитесь, что ОКТ не загрязняет поверхность ткани, так как это может помешать последующему масс-спектрометрическому анализу. Разрежьте три среза ткани толщиной 25 микрон и закрепите на предметных стеклах ПЭТ-мембраны. Аккуратно прикоснитесь мембраной к участку ткани, и снимите срез.
При слишком сильном давлении тонкая мембрана может порваться. Избегайте чрезмерного обращения с предметным стеклом перед монтажом, чтобы не нагружать мембрану из ПЭТ и не уменьшать адгезию участка ткани. Держите предметное стекло мембраны при комнатной температуре, чтобы обеспечить оттаивание и успешное сцепление ткани с мембраной.
Снимите предметное стекло с криостата и дайте ему высохнуть на воздухе в течение трех минут. Если LCM-LC-MS/MS не будет выполнен немедленно, запечатайте предметное стекло в небольшой герметичный пакет и перенесите в хранилище при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не потребуется вскрытие. Разрежьте соседний участок на расстоянии от 10 до 12 микрон и установите на стандартное предметное стекло для окрашивания гематоксилином и эозином.
В это время можно вырезать дополнительные срезы для других желаемых гистохимических красителей. Извлеките запечатанный пакет с предметным стеклом из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия и дайте нагреться до комнатной температуры в течение пяти минут. Если холодное предметное стекло будет немедленно подвергнуто воздействию лабораторной атмосферы, ткань покроется конденсатом, и пространственная целостность препарата может быть нарушена.
Включите микроскоп и лазер. Лазеру требуется от пяти до 10 минут для нагрева, прежде чем можно будет начать резку. Загрузите в держатель ПЦР-пробирки объемом 0,20 миллилитров с плоской крышкой.
После извлечения предметного стекла из пакета сделайте оптическое изображение среза ткани на ПЭТ-предметном стекле с помощью планшетного сканера. Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла тканевой стороной вниз. Назначьте отдельные пробирки для сбора данных определенным областям интереса с гранулемой с помощью программного обеспечения микроскопа.
Как правило, это непораженные легкие, клеточная гранулема и казеум, но могут варьироваться в зависимости от конкретной патологии гранулемной биопсии. Сосредоточьтесь на ткани с помощью объектива 5-кратного микроскопа. Такое увеличение должно обеспечить хороший обзор ткани, содержащей как клеточные, так и некротические участки гранулемы.
В программном обеспечении выберите трубку, обозначенную казеумом, чтобы переместить ее в положение под тканью. Введите нужные параметры рассечения. Типичными настройками для участка легкого толщиной 25 микрон являются мощность лазера 30, скорость 15 и апертура 35.
Однако они будут отличаться в зависимости от используемого микроскопа и потенциального снижения мощности из-за возраста лазера. Выберите инструмент «Свободное рисование» и с помощью мыши или пера с сенсорным экраном наметьте нужную область для рассечения. Площадь поверхности области будет отображаться в программном обеспечении.
Размер выбранных участков не должен превышать 500 000 квадратных микрон, чтобы облегчить рассечение. Повторяйте рассечение до тех пор, пока в колпачке пробирки не будет собрано в общей сложности три миллиона квадратных микрон. Иногда рассеченный участок может оставаться прилипшим к окружающей мембране и не попадать в колпачок для сбора.
Удалите эти области из общей совокупной площади поверхности, вручную выбрав и удалив их в программном обеспечении. Затем выберите колпачок для клеточного поражения и соберите три миллиона квадратных микрон ткани с помощью того же процесса. Выберите колпачок для невовлеченного легкого и соберите три миллиона квадратных микрон ткани, используя тот же процесс.
Обратите внимание, что невовлеченная легочная ткань содержит много бронхиол и альвеолярных пространств. Обратите особое внимание на исключение их из определенных участков тканей для диссекции. Снимите держатель крышки и осторожно отсоедините, запечатайте и промаркируйте каждую пробирку.
Защищайте рассеченные ткани от воздействия окружающего воздуха. Немедленно проанализируйте рассеченные ткани или храните при температуре минус 80 градусов Цельсия и разморозьте перед обработкой и анализом ЖХ/МС. Предполагая, что плотность ткани составляет один грамм на миллилитр, приготовьте гомогенатный бульон, взвесив 50 мг контрольной ткани и добавив буфер PBS для разбавления.
Гомогенизируйте ткань путем взбивания шариками легочной ткани и буфера PBS в течение пяти минут при 1750 об/мин на гомогенизаторе шариков. Затем разбавьте один миллиграмм на миллилитр запасов лекарств в соотношении один к одному ацетонитрил/вода для создания стандартных растворов для создания кривых спайков. Определите стандартные концентрации спайков на основе объема спайка и объема целевой ткани.
В иллюстрированном примере используется стандарт 100 нанограмм на миллилитр с использованием спайкового объема в 10 микролитров. Извлеките пробирки, содержащие микрорассеченную ткань, из хранилища при температуре минус 80 градусов Цельсия и дайте нагреться до комнатной температуры в течение пяти минут. Добавьте 10 микролитров раствора ацетонитрила/воды один к одному и два микролитра буфера PBS в пробирки, содержащие микрорассекаемую ткань.
Для стандартных кривых и контрольных трубок добавьте 10 микролитров спайкингового раствора к двум микролитрам контрольного гомогената легких. Добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров раствора для экстракции. Сделайте вихревой массаж каждой трубки в течение пяти минут.
Затем обрабатывайте их ультразвуком в течение пяти минут. Затем центрифугируйте пробирки при 5 000 об/мин в течение пяти минут, чтобы сформировать гранулу пленки и ткани в каждой пробирке. После центрифугирования перелейте 50 микролитров надосадочной жидкости в 96-луночный глубоколуночный планшет и разбавьте еще 50 микролитрами деионизированной воды в каждой лунке.
Наконец, выполните анализ LC-MS/MS и валидацию метода, как описано в текстовом протоколе. Метод LCM-LC/MS был впервые валидирован путем анализа микродиссекированных лазером областей гомогената тканей, спайковых этамбутолом. Как показано здесь, метод был высоко воспроизводим и продемонстрировал отличное восстановление лекарств.
Концентрации этамбутола, измеренные с помощью LCM-LC/MS в нескольких тканях легких, были дополнительно подтверждены путем прямого сравнения с концентрациями, определенными с помощью установленного подхода LC/MS. Эквивалентные концентрации были обнаружены с помощью обоих методов. Абсолютные концентрации этамбутола в непораженной паренхиме легкого, ободке клеточного поражения и некротизированном каземе определяли методом ЖХМ-ЖХ/МС.
Уровни стерилизации микобактерий туберкулеза были достигнуты во всех пораженных компартментах. Указаны минимальные концентрации, необходимые для уничтожения 99% внеклеточных реплицирующихся бацилл и 99% внутриклеточных бацилл в макрофагах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить микропрепарирование тканей и количественную оценку уровней лекарств в определенных структурах легочной гранулемы.
Этот метод позволяет исследователям в области исследований противомикробных препаратов точно и количественно оценивать, достигают ли вводимые препараты целевых популяций патогенов в стерилизующих концентрациях. Этот подход широко применим ко многим различным тканям и заболеваниям.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол количественного определения распределения лекарственных препаратов в гранулемах при туберкулезе легких с использованием лазерной микродиссекции и анализа методом ЖХ-МС. Данный метод обеспечивает высокую пространственную детализацию при измерении концентраций препаратов в конкретных тканевых структурах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Фармакология
- Микробиология
Теоретические основы
- Понимание распределения лекарственных препаратов в очагах туберкулеза имеет решающее значение для эффективного лечения.
- Этамбутол — это противотуберкулезный препарат, который должен достигать стерилизующих концентраций.
- Гранулемы представляют собой сложные структуры, в которых могут сохраняться бактерии.
- Современным методам не хватает пространственного разрешения, необходимого для детального анализа.
Цель исследования
- Количественно определить концентрацию этамбутола в тканях очагов туберкулеза.
- Оценить, достигают ли концентрации препарата эффективного уровня во всех отделах гранулемы.
- Предоставить визуальную демонстрацию метода для лучшего понимания.
Используемые методы
- Лазерная захватная микродиссекция для выделения специфических участков ткани.
- Анализ методом ЖХ-МС для количественного определения концентрации препарата.
- Срезы тканей с использованием криостата при контролируемых температурах.
- Тщательное закрепление образцов ткани во избежание загрязнения.
Основные результаты
- Метод позволяет успешно количественно определить уровни препарата в различных компартментах гранулемы.
- Продемонстрирована возможность визуализации распределения препарата с высоким пространственным разрешением.
- Получены данные об эффективности этамбутола в достижении популяций бактерий.
- Освещены трудности при работе с тканями и их подготовке.
Выводы
- Данный метод представляет ценность для поиска и разработки противотуберкулезных препаратов.
- Он позволяет исследователям понять динамику распределения лекарственных средств в тканях.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для совершенствования стратегий лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точный пространственный количественный анализ концентраций препаратов в компартментах гранулемы имеет решающее значение для оценки того, достигают ли противотуберкулезные средства бактерицидных уровней в областях некротического казеозного распада и клеточных поражений. Эта возможность напрямую влияет на принятие решений о продолжении или прекращении разработки препаратов против туберкулеза, позволяя механистически снизить риски, связанные с взаимодействием с мишенью и адекватностью фармакокинетики. Данный метод обеспечивает прогностическую уверенность при оптимизации ведущих соединений, связывая воздействие препарата со стерилизующими концентрациями в гетерогенных микросредах очагов поражения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, определяя, достигают ли лекарственные препараты стерилизующих концентраций в конкретных компартментах гранулемы.
- Практическая ценность: предоставляет количественные данные с пространственным разрешением для снижения рисков при валидации мишеней в сложных системах, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей стандартизации анализов путем выделения патологически различных участков ткани.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимости анализов и получение количественных данных, необходимых для надежной оценки соединений в каскадах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает соответствие патологии заболевания путем количественного определения уровней препарата в структурах гранулом, релевантных для человека, что позволяет согласовать трансляционные биомаркеры.
- Практическая ценность: облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков благодаря данным, охватывающим весь период от этапа поиска до доклинической валидации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств, предоставляя данные о пространственном распределении концентрации препарата, что способствует идентификации ведущих соединений и проведению доклинических исследований за счет механистического снижения рисков, связанных с взаимодействием препарата с мишенью в компартментах гранулемы.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем количественного определения распределения препарата в областях некротических и клеточных поражений.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа за счет высокоточного выделения тканевых компартментов для согласованного тестирования соединений.
- Аналитика: позволяет получать данные об абсолютной концентрации препарата, что дает возможность проводить сравнение различных условий и моделирование зависимости «экспозиция — ответ».
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями, предоставляя данные по проникновению препарата в казеозное ядро и периферическую зону гранулемы на релевантных тканях человека.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для пространственно-разрешенного количественного определения препаратов, применимую при различных патологических состояниях, характеризующихся наличием структурированных поражений.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишени, снижение механистической неопределенности в вопросах взаимодействия препарата с пораженным участком.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов количественного определения препаратов с пространственным разрешением.
- Стратегическая ценность: Улучшение процесса принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях противоинфекционных программ.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе данных о воздействии препарата в конкретных компартментах.
Особенности реализации
- Опыт работы с методом лазерной захватывающей микродиссекции и навыки обращения с тканями для предотвращения контаминации и обеспечения пространственной целостности.
- Доступ к криостату, оборудованию для жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS/MS) и экстракционным растворам ацетонитрил/вода для обработки образцов.
- Межкомандная стандартизация между специалистами по гистологии, молекулярному анализу и фармакологии для согласованного определения интересующих областей (ROI).
- Учет особенностей адаптации к различной патологии гранулем и плотности тканей в разных моделях заболеваний.
- Практические ограничения включают хрупкость срезов тканей и возможность влияния OCT на масс-спектрометрический анализ при отсутствии надлежащего контроля.
