Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации морфогенеза ветвления и структурирования периферических нервов и кровеносных сосудов, а также распределения иммунных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, сосудистой биологии и иммунологии, проливая свет на морфологические аномалии в периферических нервах и кровеносных сосудах, а также на воспаление. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем визуализировать клеточные компоненты периферических нервов, кровеносных сосудов и иммунных клеток в коже по всей ее глубине и сравнивать трехмерную архитектуру нервной и сосудистой систем.

Этот метод может дать представление о структурах нейрососудистой системы и распределении иммунных клеток у молодых и взрослых мышей в нормальных и патологических условиях. После усыпления взрослых мышей в соответствии с текстовым протоколом отделите ухо от основания и поместите его в чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров, содержащую два миллилитра HBSS. Затем с помощью ножниц кратко подстригите волоски.

Осторожно отшелушите заднюю и переднюю кожу от промежуточного хряща. Перенесите каждый участок кожи отдельно в 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр ледяного, свежего 4% PFA в PBS на лунку. Затем разровняйте кожу в ПФА.

Далее зафиксируйте заднюю и переднюю кожу хрящами при температуре четыре градуса Цельсия на один час. Затем используйте один миллилитр PBS для полоскания кожи три раза в течение пяти минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре. Перенесите кожу с хрящом на дно чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров.

С помощью тонких изогнутых щипцов отшелушите хрящ от передней части кожи. Затем отрежьте область основания, которая свернута и имеет жировую и соединительную ткани. С помощью тех же щипцов аккуратно удалите волоски, жировую ткань и соединительную ткань с внутренней стороны задней части кожи.

Используйте PBS, чтобы поддерживать кожу влажной. Чтобы провести иммуногистохимическое окрашивание всего монта, перенесите заднюю и переднюю поверхность кожи на 24-луночный планшет, содержащий один миллилитр 10% термоинактивированного буфера для блокирования сыворотки на лунку. Инкубируйте кожу при аккуратном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 минут.

Разведите первичные антитела в блокирующем буфере, как описано в текстовом протоколе, и добавьте в лунку 150 микролитров первичных антител из блокирующего буфера. Затем перенесите заднюю и переднюю части кожи в новые лунки, содержащие первичные антитела. Инкубируйте кожуру при слабом перемешивании при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день, после переноса кожи в новые лунки или аспирации первичных антител, добавьте один миллилитр 2%-ной сыворотки в PBS с 0,2%-ным Тритоном Х-100. Промойте образцы при аккуратном перемешивании при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите стирку еще два раза.

Тем временем приготовьте вторичные антитела в 10%-ном блокирующем буфере и отфильтруйте растворы антител через мембранный шприцевой фильтр PVDF толщиной 0,22 микрометра, подключенный к одномиллилитровому шприцу. Центрифугируйте раствор при 13 000-кратном течении силы тяжести в течение 10 минут, чтобы удалить агрегированные частицы вторичных антител из блокирующего буфера, добавив в новую лунку 150 микролитров вторичных антител из блокирующего буфера. Перенесите кожу в лунку, содержащую вторичные антитела.

Оберните 24-луночный планшет алюминиевой фольгой, чтобы защитить его от света, и инкубируйте кожу при осторожном перемешивании при комнатной температуре в течение одного часа. Добавьте один миллилитр 2%-ной сыворотки в буфере для стирки. Затем перенесите заднюю и переднюю кожу в лунки, содержащие промывочный буфер.

Оберните тарелку, и промойте образцы с помощью аккуратного перемешивания при комнатной температуре в течение 15 минут. Повторите стирку еще два раза. Положите кожу на дно чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров.

Затем под стереомикроскопом с низкой освещенностью, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, с помощью тонких изогнутых щипцов аккуратно удалите волосы, жировую ткань, соединительную ткань, пыль и волокна с внутренней стороны кожи. Используйте PBS, чтобы поддерживать кожу влажной. С помощью щипцов перенесите заднюю и переднюю кожу внутренней стороной вверх на предметное стекло для липкого микроскопа.

Используйте щипцы для выравнивания кожи. Поместите кожу в жидкий монтажный материал, препятствующий выцветанию, чтобы избежать фотообесцвечивания и сохранить флуоресцентные сигналы. Следите за тем, чтобы на коже или вокруг нее не было пузырьков воздуха.

Храните предметные стекла с окрашенной кожей в темноте в течение ночи при комнатной температуре, чтобы монтажный материал стал твердым. Затем используйте лак для ногтей, чтобы приклеить покровное стекло к предметному стеклу, и храните его при температуре четыре градуса Цельсия для длительного хранения. Чтобы провести конфокальную микроскопию, настройте соответствующие лазеры для флуорофоров.

В эксперименте используется конфокальный микроскоп с тремя лазерными источниками. Визуализируйте образцы под объективом 10X и используйте инструмент последовательного сканирования, который одновременно возбуждает образцы с тройным окрашиванием, чтобы избежать и уменьшить любое перекрытие. В этом эксперименте кожа заднего уха и кожа переднего уха взрослой мыши были иммуноокрашены антителами к альфа-СМА, Tuj1 и PECAM-1.

Заднюю часть кожи окрашивали иммуно для изучения нейроиммунного распределения с использованием антител к CD11b и MBP вместе с Tuj1. Наконец, как показано здесь, распределение CD11b-положительных воспалительных клеток, включая макрофаги, было обнаружено с разрешением одной клетки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с кожей и аккуратно и медленно удалять волоски, жировую ткань и соединительную ткань с внутренней стороны кожи уха перед установкой.

Этот метод проложит путь для исследователей к изучению разветвленного морфогенеза и структурирования периферических нервов и кровеносных сосудов, а также трехмерного распределения компонентов кожи, включая иммунные клетки в моделях молодых и взрослых мышей. Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.