Простой, быстрый и количественные Assay мера ремонт ДНК белковых сшивки на плазмид Transfected в клетки млекопитающих

Цель настоящего Протокола заключается в количественном определении ремонт определенных ДНК белковых сшивки на плазмидной ДНК. Пораженного плазмид transfected в получателей mammalian клетки линии и низкомолекулярных вес, собирают в несколько раз очков после transfection. Кинетика ремонта ДНК количественно с помощью расширения ленты специфического праймера, следуют ПЦР.

Общая цель этого эссе QPCR о транстихоокеанском расширении праймера заключается в количественной оценке репарации аддуктов, сшитых с плазмидной ДНК, после трансфекции в клетки млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репарации ДНК. Например, какие пути участвуют в восстановлении поперечных связей белков ДНК.

Этот метод может обеспечить лучшее понимание реакции на повреждение ДНК. Потому что это позволяет избирательно изучать репарацию сшивок белков ДНК и отсутствие других типов повреждений ДНК. Хотя этот метод может дать представление о восстановлении сшивок белков ДНК, он также может быть применен к другим типам повреждений ДНК.

Такие как абазисные сайты и другие полимераза, блокирующие аддукты. Основным преимуществом этого метода является то, что он может обнаруживать репарацию аддук-содержащих плазмид в течение нескольких часов. Первоначально мы планировали использовать реактивацию домашних клеток для изучения репарации, однако эти анализы не измеряют репарацию напрямую или могут переоценивать эффективность репарации.

Особенно если РНК-полимераза может считывать незавершенные продукты восстановления. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку в противном случае этапы очистки и удлинения праймера, специфичные для нити, трудно визуализировать. Смешайте 20 микролитров раствора, содержащего 80 пикомолев из восьми оксогуанинсодержащих олигонуклеотидов, с пятью микролитрами 10-кратного лигазного буфера.

И добавить один микролитр раствора, содержащего 10 единиц Т4 полинуклеотидкиназы. Отрегулируйте итоговый объем до 50 микролитров и выдержите пробирку на водяной бане в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Далее проходят реакция удлинения праймера на льду.

Установите программу на термоамплификатор и запустите прогон. После инкубации отрегулируйте общий объем до 375 микролитров, добавив различные реагенты, ферменты и буфер. Затем инкубируйте реакцию на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Для приготовления фенилхлороформной смеси в соотношении 50:50 добавьте равные объемы фенола и хлороформа. Затем смешайте оба компонента и вращайте в настольной центрифуге при температуре 21, 130 G в течение пяти минут. После того, как отжим закончится, добавьте 375 микролитров органического слоя в реакцию праймер-наращивания. Смешивать.

И снова центрифугировать при 21, 130 G в течение пяти минут. После центрифугирования тщательно пипетируйте верхний слой. И смешать с ацетатом аммония до конечной концентрации 0,3 моляра.

А затем добавить в него два объема 100% этанола. Храните смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 30 минут до ночи. По окончании инкубационного периода центрифугируйте образец при 15 000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу в 70% этаноле. Снова вращайте образец в настольной центрифуге при 15 000 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и растворите гранулу в 100 микролитрах воды.

Соедините 50 микролитров ДНК с 34 микролитрами воды и 16 микролитрами 6-кратного гелеобразного красителя. Проведите исследование на 10-сантиметровом 0,8%-ном низкоплавком агарозном геле, содержащем 0,5 микрограмма на миллилитр бромида этидия при напряжении 2 вольта на сантиметр в течение шести часов в 1x TAE буфере. Затем с помощью бритвенного лезвия вырезайте суперспиральную ДНК.

И взвесьте гелевый ломтик. Далее добавьте один микролитр буфера для реакции бета-агаразы, чтобы переварить каждые 10 миллиграмм кусочка геля. Затем инкубируйте ломтик при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем охладите до 42 градусов Цельсия в термоамплификаторе.

Как только гелевый ломтик растворится и остынет до 42 градусов по Цельсию, добавьте 10 единиц бета-агаразы и оставьте при температуре 42 градуса Цельсия на один час в термоамплификаторе. Через час измерьте объем растворенного геля срезом и добавьте ацетат аммония до конечной концентрации 0,3 моляра и выдержите на льду в течение 15 минут. После инкубации смесь центрифугировать при 15 000 г в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем соберите супернатант и пипеткой наберите к нему два объема изопропанола и перемешайте. Затем храните смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день центрифугируйте очищенную суперспиральную ДНК в настольной центрифуге при 15 000 оборотах в минуту в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Достаньте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 40 микролитрах воды. Затем соедините в буфере 15 микролитров раствора, содержащего 12 пикомолев ДНК, с одним микролитром раствора 36 пикомолев оксогуанингликозилазы и отрегулируйте итоговый объем до 30 микролитров. Затем выдержать смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут на водяной бане.

За сутки до трансфекции засейте клетки в шестилуночный культуральный планшет. На следующий день смешайте 1,5 микрограмма сшитой плазмиды с 300 микролитрами бессывороточной питательной среды в одной пробирке, сохраняя один микролитр ДНК в качестве точки нулевого часа. В другой пробирке смешайте 12 микролитров трансфекционного реагента с 300 микролитрами среды, не содержащей сыворотки.

Затем соедините 300 микролитров сшитой ДНК с равным объемом разведенного реагента для трансфекции. И выдерживать в течение пяти минут при комнатной температуре в вытяжке с ламинарным потоком. После инкубации добавьте по 250 микролитров комплекса в каждую из двух лунок и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия.

Минимум через один час удалите среду и добавьте один миллилитр 0,6%-ного раствора додецилсульфата натрия с 0,1 молярного ЭДТА и инкубируйте при комнатной температуре от 10 до 15 минут. Затем отсоедините клетки путем соскабливания резиновым полицейским и переложите в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Далее добавьте 200 микролитров 5 молярного раствора хлорида натрия до конечной концентрации в один моляр и переверните трубку пять раз.

Затем инкубировать при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день центрифугируйте образец при 21, 130 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования соберите супернатант.

И добавьте ацетат аммония до конечной концентрации 0,3 моляра, перемешайте и добавьте два объема 100% этанола для осаждения ДНК. Храните смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 30 минут. После осаждения этанола и ресуспендирования восстановленных образцов ДНК в 50 микролитрах воды разбавляют образец нулевого часа в 500 микролитрах воды и проводят ПЦР-реакцию с использованием нетрансфицированных и трансфицированных образцов.

Затем установите программу на термоамплификатор и запустите прогон. Этот этап удлинения трансспецифичного праймера имеет решающее значение, потому что он позволяет нам усилить поврежденную цепь. Если значение дельта ТТ не используется, оно будет меньше единицы, что затруднит обнаружение низких уровней восстановления DPC.

Завершив восемь циклов, добавьте 100 пикомолев второго праймера. Затем смешайте один микролитр неамплифицированной ДНК из нетрансфицированных и трансфицированных образцов с 2-кратной мастер-смесью, водой и 100 пикомолами обоих праймеров до конечного объема 60 микролитров. Загрузите образцы в трех экземплярах на 96-луночный ПЦР-планшет.

Проведите количественную ПЦР в течение 30 циклов и усредните порог цикла для каждого из тройных образцов. В данном исследовании КПЦР проводится с удлинением специфичного для нити праймера и без него с целью расчета процента репарированной плазмидной ДНК. Разница в пороговых значениях цикла между образцами, удлиненными и не удлиненными праймерами, называется дельта, CT.As здесь мы видим, что отремонтированный образец, подвергнутый SSPE-QPCR, имеет большую дельту CT, чем неотремонтированный образец.

Репрезентативные данные о проценте восстановления, рассчитанные на основе дельта-КТ, показывают, что образцы, восстановленные через три часа после трансфекции, восстанавливаются на 66%, в то время как образцы, восстановленные через восемь часов, восстанавливаются на 93%. Здесь приведены процентные фоновые значения, рассчитанные по двум контрольным образцам с высокой и низкой эффективностью сшивания белков соответственно. Низкий процент фона, присутствующий в контроле, указывает на то, почему для трансфекции используются только эффективно сшитые субстраты.

Как только вы освоите эту технику, это можно будет сделать за два-три часа. При попытке выполнить эту процедуру важно взять нулевое количество образцов, чтобы вычесть любой фон из этого анализа. Следуя этой процедуре, можно выполнить другие методы, такие как анализ последовательностей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: подвержена ли ошибкам восстановления DPC?

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготавливать, трансфектировать и количественно оценивать репарацию аддук-содержащих плазмид в клетках млекопитающих. Не забывайте, что работа с фенолом, хлороформом и бромидом этидия может быть опасной. И всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа в вытяжном шкафу.