Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием
3 мая 2018 г.
Здесь мы описываем протокол для автоматической сегментации дневно обозначенные тканей на слайдах с помощью системы анализа высоким содержанием widefield (WHCAS). Этот протокол имеет широкие применения в любой области, которая включает в себя количественный флуоресцентных маркеров в биологических тканях, включая биологических наук, медицинской техники и медицинских наук.
Общая цель этого метода визуализации и анализа заключается в создании простого в настройке рабочего процесса для автоматической сегментации любого образца ткани, помеченного флуоресцентным способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологических наук о том, сколько данного белка обнаружено в определенной области образца ткани, представляющем интерес. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что можно сэкономить время, оптимизирующее протоколы для автоматической сегментации, что позволяет применять этот метод к последующим образцам тканей, помеченным флуоресцентно метками.
Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда нам понадобилось количественно оценить новые клетки в ткани мозга при большом увеличении. После импорта журналов откройте диалоговое окно «Настройка получения номерных знаков» и перейдите на вкладку «Объектив и камера». Установите Увеличение (Magnification) на четыре раза, Биннинг камеры (Camera) на единицу, а Gain (Усиление) на два.
Откройте вкладку Сканирование слайдов пластин и введите соответствующие экспериментальные настройки. На вкладке «Площадки для посещения» равномерно заполните скважины участками и откройте вкладку «Редактировать настройки дна пластины», чтобы ввести соответствующие экспериментальные значения. Сохранив эти настройки в качестве Настройки А, откройте вкладку Объектив и Камера и установите Увеличение на 40 раз, Биннинг камеры на один, а Усиление на два.
Убедитесь, что все настройки на вкладках «Сканирование слайда пластины» и «Редактирование настроек дна пластины» совпадают с настройками А. И откройте вкладку «Цикл сбора». Введите количество длин волн, присутствующих в образце, и отметьте параметры «Включить лазерную фокусировку» и «Включить фокусировку на основе изображения». Затем сохраните эти настройки как Настройка В. Далее разместите до трех слайдов, накрыв их скользящей планкой лицевой стороной вниз этикеткой на боковой стороне выемки в адаптер слайда.
И нажмите F4, чтобы открыть главное меню. Выберите «Сканирование слайдов» и нажмите «Открыть дверцу, извлечь слайд», чтобы вставить адаптер слайда в широкопольную систему анализа высокого содержания. Затем нажмите кнопку «Закрыть дверную загрузку».
Для начала убедитесь, что выбрана соответствующая длина волны. Переходите к различным местам в изображении функции в реальном времени, пока не будет найден интересующий регион. Сосредоточьтесь на регионе.
Если он не находится в фокусе, используйте кнопку автофокусировки или отрегулируйте размер шага до тех пор, пока он не будет сфокусирован. Используйте функцию «Привязка» для захвата изображения, если вы вручную настраиваете фокус путем изменения размера шага. Чтобы настроить предыдущее сканирование, сначала загрузите настройку A и выберите «Предварительный просмотр слайдов».
Укажите количество слайдов и нажмите кнопку ОК. Выберите четырехкратное увеличение. Затем выберите Cover slip down и продолжайте выбирать базовые настройки для предыдущего сканирования. Убедитесь, что установлены флажки Настройка сбора данных и Калибровка, прежде чем выбрать Отмена и нажать Продолжить.
На вкладке W1:DAPI нажмите «Live», а затем «Auto Expose», а затем «Snap». После этого нажмите Close. Выберите каталог и введите имя предыдущего сканирования.
Диалоговое окно «Область рисования» появится автоматически. С помощью инструмента прямоугольной области выберите всю предыдущую область сканирования и нажмите кнопку Продолжить. В конце предыдущего сканирования загрузите Настройка B и откройте вкладку Сайты для посещения.
Для начала убедитесь, что выбрана соответствующая длина волны. Переходите к различным местам в изображении функции в реальном времени, пока не будет найден интересующий регион. Сосредоточьтесь на регионе.
Если он не находится в фокусе, используйте кнопку автофокусировки или отрегулируйте размер шага до тех пор, пока он не будет сфокусирован. Используйте функцию «Привязка» для захвата изображения, если вы вручную настраиваете фокус путем изменения размера шага. Затем на вкладке W1 DAPI нажмите «Автоэкспонирование» и убедитесь, что изображение DAPI Plate Acquisitions Snap является четким.
В главном меню нажмите «Журнал» и выберите «Запустить журнал» в раскрывающемся меню. Дважды щелкните журнал настройки получения области слайда, чтобы запустить, и нажмите кнопку Продолжить, когда появится диалоговое окно настройки получения области слайда. Получив указания, выберите «Сканирование DAPI», чтобы выбрать изображение слайда с малым увеличением, и нажмите кнопку «ОК». Когда появится запрос на Plate Acquisition Snap, выделите Plate Acquisition Snap-DAPI и нажмите OK. Когда появится окно «Создать или загрузить регионы», используйте инструмент «Прямоугольная область» для выбора областей интереса на сканировании DAPI и нажмите кнопку «Продолжить».
С помощью инструмента поиска выделите интересующую область и нажмите Продолжить в диалоговом окне Выбрать регион. Когда появится окно Подтвердить регионы, нажмите кнопку Продолжить и решите, нужно ли сохранять регион, когда появится диалоговое окно Сохранить регионы. Появятся три диалоговых окна.
Нажмите кнопку Продолжить, чтобы закрыть поле Настройка завершена. Чтобы исключить догадки о поиске места отбора проб, убедитесь, что установлен флажок Отображать изображения во время съемки на вкладке Настройки отображения, а на вкладке Сводка нажмите кнопку Получить пластину, чтобы определить местоположение области предварительно выбранной области интереса. Когда камера перемещается по сайту, содержащему интересующие клетки, нажмите кнопку «Отмена», чтобы остановить получение изображения.
Не пугайтесь, если изображение не в фокусе. Этот шаг предназначен исключительно для позиционирования площадки первого сайта в выбранном вами регионе интереса. Убедитесь, что сцена расположена над выборкой и что вы правильно ввели количество сайтов.
Оптимизируйте настройки длины волны, чтобы обеспечить получение изображения с высоким динамическим диапазоном. Затем снова откройте вкладку «Сводка» и нажмите «Получить номерной знак». В конце анализа выберите вкладку Отображение.
В раскрывающемся меню «Наложение изображений» выберите «Показать информацию об источнике», чтобы номера сайтов отображались в верхнем левом углу. Прокрутите сайты и исключите любые участки, которые находятся вне фокуса и/или содержат складки ткани или пузырьки и разрывы в ткани. На этом репрезентативном изображении показаны миниатюры с большим увеличением всех сайтов в пределах определенной области интереса.
Каждый сайт должен быть проверен на предмет выявления участков, которые должны быть исключены из анализа. Например, в этом эксперименте Зона 149 была вне фокуса, Зона 219 имела пузыри, а Зона 54 содержала складку. Все эти три объекта были исключены из анализа.
Здесь соответствующие наложения, сгенерированные модулем оценки многоволновых ячеек, демонстрируют результаты автоматизированной сегментации, выполненной на участке 59, как они были настроены в соответствии с экспериментальными спецификациями. После сегментации можно получить количественные данные о доле клеток с положительным окрашиванием для каждого маркера, обоих маркеров, отсутствия маркеров, средней площади окрашивания и средней интенсивности флуоресценции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как настроить систему анализа высокого содержания в широком поле для создания автоматизированного рабочего процесса для визуализации и сегментации образца ткани, установленного на предметном стекле.
Обзор
В данной статье представлен протокол автоматизированной сегментации флуоресцентно меченых тканей с использованием системы широкопольного высокопроизводительного анализа (WHCAS). Этот метод оптимизирует количественную оценку флуоресцентных маркеров в биологических тканях, что полезно для различных областей, включая биологические науки и медицинскую инженерию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биологические науки
- Медицинская инженерия
- Науки о здоровье
Теоретические сведения
- Автоматизированная сегментация улучшает анализ тканей с флуоресцентной меткой.
- Системы высокопроизводительного анализа (high-content analysis) облегчают детальную визуализацию биологических образцов.
- Количественное определение белков в образцах тканей имеет решающее значение для понимания биологических процессов.
- Данный метод был разработан для решения проблем количественного определения новых клеток в тканях головного мозга.
Цель исследования
- Создать эффективный рабочий процесс для автоматической сегментации образцов тканей.
- Повысить точность и скорость количественного определения флуоресцентных маркеров.
- Предоставить стандартизированный протокол, применимый к различным типам тканей.
Используемые методы
- Настройка системы широкопольного высокопроизводительного анализа для получения изображений.
- Конфигурация экспериментальных параметров для оптимизации визуализации.
- Использование программных инструментов для сбора и анализа изображений.
- Применение автофокусировки и методов фокусировки по изображению.
Основные результаты
- Была успешно проведена сегментация флуоресцентно меченных тканей.
- Визуализация с большим увеличением позволила детально рассмотреть образцы тканей.
- Области интереса были точно определены и проанализированы.
- Были установлены критерии исключения для расфокусированных или поврежденных изображений.
Выводы
- Протокол автоматизированной сегментации значительно сокращает время анализа.
- Данный метод может быть применен к широкому спектру биологических тканей.
- Будущие применения могут расширить возможности исследований в различных областях науки.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Автоматизированное сканирование и сегментация предметных стекол с использованием системы широкопольного высокопроизводительного анализа (WHCAS) устраняют узкое место при количественном определении флуоресцентных маркеров в больших срезах тканей, обеспечивая воспроизводимый высокопроизводительный анализ для валидации мишеней и разработки методов анализа. Благодаря стандартизации процессов получения изображений и сегментации данный метод снижает вариабельность и ускоряет доклиническую оценку тканевых биомаркеров, поддерживая принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного анализа паттернов экспрессии белков в тканях, имеющих значение для заболевания.
- Практическая ценность: сокращает время на оптимизацию протоколов для отдельных экспериментов, обеспечивая возможность быстрого применения метода для множества флуоресцентно меченных мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет получения стабильных количественных данных о локализации маркеров и уровнях их экспрессии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем создания стандартизированных сегментированных изображений тканей, подходящих для высококонтентного анализа.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет автоматизированного выбора областей и исключения поврежденных участков (например, расфокусированных, складчатых или имеющих пузырьки воздуха).
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных маркеров и типов тканей благодаря встроенным программным модулям для анализа локализации белков, пролиферации, жизнеспособности, апоптоза и ангиогенеза.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает согласованность данных от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя количественные показатели доли маркероположительных клеток, средней площади окрашивания и интенсивности флуоресценции.
- Продвижение с учетом рисков: поддерживает процесс принятия решений на доклиническом этапе за счет предоставления надежных, отфильтрованных от артефактов наборов данных, отражающих истинный биологический сигнал.
- Релевантная системе заболевания модель: продемонстрированная применимость при анализе тканей опухолей головного мозга с возможностью расширения на любые флуоресцентно-меченые ядерные или цитоплазматические маркеры в тканях на предметных стеклах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки от этапа раннего поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая стандартизированный анализ тканей на каждой из этих стадий.
- Открывающая биология (Discovery Biology): обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем количественного определения экспрессии маркеров в конкретных интересующих областях тканей.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет автоматизированной сегментации и количественных результатов, что позволяет проводить надежную оценку соединений в различных центрах.
- Аналитика: генерирует измеримые показатели, включая долю положительных клеток, среднюю площадь окрашивания и среднюю интенсивность флуоресценции, что позволяет проводить сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, предоставляя количественные данные о тканях, согласованные с биомаркерами и подходящие для валидационных исследований.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовой инструмент в различных проектах, используя готовые программные модули и сохраненные настройки (Настройки A и B) для обеспечения согласованности сканирования и сегментации препаратов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение прогностической достоверности валидации мишеней, снижение механистической неопределенности в анализах на основе тканей.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов визуализации и анализа тканей.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала за счет сокращения времени оптимизации протоколов и снижение биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: приоритизация и решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных данных по тканям, подтвержденных методом исключения.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с системами широкопольного высокопроизводительного анализа (high-content analysis) и соответствующим программным обеспечением.
- Необходимо оборудование, поддерживающее сканирование предметных стекол, многоволновой захват данных, а также лазерную и программную фокусировку по изображению.
- Необходима межкомандная стандартизация настроек сбора данных (например, увеличения, биннинга, усиления) и протоколов определения областей интереса.
- Требуется адаптация метода при применении к различным типам тканей, различной экспрессии маркеров или разной толщине срезов на стеклах.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость ручного исключения участков с артефактами (например, расфокусированных изображений, складок ткани, пузырьков воздуха), несмотря на автоматизированный сбор данных.
