Идентификация Дофаминовый рецептор D1-альфа в пределах грызунов прилежащем инновационные РНК в месте обнаружения технологии

Общая цель этого нового анализа РНК-гибридизации in-situ заключается в визуализации отдельных молекул РНК в определенной области мозга, которые имеют решающее значение для уточнения дофаминергической дисфункции при заболевании центральной нервной системы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как дофаминергические аномалии, опосредующие поведенческие реакции и модулирующие функцию рабочей памяти. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает новую технику гибридизации in situ для исследования дисфункции дофаминовой системы во время прогрессирования заболеваний центральной нервной системы.

Хотя этот метод может дать представление об общих уровнях экспрессии мРНК-мишени в данной области мозга, он также может быть применен для определения того, как транскрипты мРНК распределяются по клеткам данной области. Чтобы начать эту процедуру, в течение пяти минут после сбора мозга взрослой крысы погрузите его в жидкий азот на 15 секунд. Далее уравновесьте мозг при температуре минус 20 градусов Цельсия в криостате в течение одного часа.

Через час отрежьте 30 микронных срезов, содержащих прилежащее ядро, от 2,76 мм до 2,28 мм перед брегмой и установите их на предметные стекла. Затем просушите срезы при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем погрузите предметные стекла в предварительно охлажденный 4% параформальдегид на один час при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем поместите предметные стекла в возрастающий градиент этанола при комнатной температуре, затем перенесите предметные стекла в свежий 100% этанол еще на пять минут. После этого поместите слайды на впитывающую бумагу, чтобы дать им высохнуть на воздухе. Нарисуйте барьер вокруг каждого участка с помощью барьерного пера.

Дайте барьеру полностью высохнуть в течение одной минуты. Чтобы предварительно обработать участки мозга, включите духовку и установите температуру 40 градусов по Цельсию. Добавьте по три капли реагента перед обработкой на каждый участок мозга.

Затем инкубируйте секции в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем погрузите слайды в 1X PBS на одну минуту при комнатной температуре и перенесите слайды в свежий 1X PBS еще на минуту. Слайды не должны оставаться в 1X PBS дольше 15 минут.

Чтобы провести мультиплексный анализ, нагрейте целевой зонд в течение 10 минут при температуре 40 градусов Цельсия на водяной бане, а затем охладите до комнатной температуры. Поместите РНК-реагент при комнатной температуре. Удалите лишнюю жидкость со слайдов с помощью впитывающей бумаги и поместите их обратно на решетку для слайдов.

Затем добавьте три капли Drd1alpha в качестве зонда на каждый срез образца и инкубируйте образцы в течение двух часов при температуре 40 градусов Цельсия. После этого дважды промойте предметные стекла в буфере для стирки 1X в течение двух минут при комнатной температуре. Затем удалите лишнюю жидкость со слайдов впитывающей бумагой и поместите их обратно на решетку для слайдов.

Не допускайте пересыхания участков мозга между этапами инкубации. Добавьте три капли AMP 1FL на каждый срез образца и инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре 40 градусов Цельсия. После этого дважды промойте предметные стекла в буфере для стирки 1X в течение двух минут каждый раз при комнатной температуре.

Затем удалите лишнюю жидкость со слайдов впитывающей бумагой и поместите их обратно на решетку для слайдов. Затем добавьте по три капли AMP 2FL на каждый срез образца. Инкубируйте образцы в течение 15 минут при температуре 40 градусов Цельсия.

Далее дважды погрузите предметные стекла в буфер для стирки 1X на две минуты при комнатной температуре. Удалите лишнюю жидкость со слайдов с помощью впитывающей бумаги и поместите их обратно на решетку для слайдов. Добавьте три капли AMP 3FL на каждый срез образца и инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре 40 градусов Цельсия.

Далее промойте слайды в буфере для стирки 1X в течение двух минут при комнатной температуре дважды. Удалите лишнюю жидкость со слайдов с помощью впитывающей бумаги и поместите их обратно на решетку для слайдов. Затем добавьте три капли AMP 4FL ALT A на каждый срез образца и инкубируйте образцы в течение 15 минут при температуре 40 градусов Цельсия.

Промойте предметное стекло в буфере для стирки 1X в течение двух минут при комнатной температуре дважды. Удалите лишнюю жидкость со стекол и сразу же нанесите по две капли монтажного реагента на каждую секцию. Затем наденьте покровный лист размером 22 на 22 миллиметра на каждый участок мозга.

Затем храните предметные стекла в темноте при температуре от двух до восьми градусов Цельсия до полного высыхания. Для получения изображений включите конфокальный микроскоп и переключитесь на объектив с 60-кратным увеличением. Получение изображений стека Z и получение изображений меченых Drd1alpha клеток в области прилежащего ядра.

Для изображений прилежащего ядра, на которых отображался рисунок окрашивания дискретными точками, динамический диапазон экспрессии оценивали с помощью полуколичественного анализа. Каждая ячейка была оценена от нуля до девяти в зависимости от количества точек в ячейке. Таким образом, этот метод гибридной оценки сигнала позволяет оценить степень и вариабельность экспрессии Drd1alpha в отдельных клетках.

Вот репрезентативные конфокальные изображения экспрессии Drd1alpha у самцов и самок крыс с дискретным рисунком окрашивания точками. Чтобы учесть вложенную структуру данных, были рассчитаны средние значения количества для каждой категории и использованы для статистического анализа. Был проведен U-тест Манна-Уитни для оценки различий в медианном количестве клеток у самцов и самок крыс.

Частота ячеек в каждой категории анализируется с помощью относительной частоты и кумулятивной частоты. У самок животных наблюдался значительный сдвиг в распределении с большей частотой клеток в категориях более низкого порядка по сравнению с самцами. В целом, полученные результаты свидетельствуют о явных половых различиях в экспрессии Drd1alpha в прилежащем ядре.

После освоения этой техники ее можно выполнить за семь часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости работать быстро, так как изменения температуры или высыхание ткани могут повредить мРНК и затруднить получение надежного сигнала. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять технику гибридизации in situ в корковых тканях, флуоресцентно визуализировать сигнальные транскрипты мРНК в выбранных областях мозга и характеризовать распределение транскриптов мРНК для статистического анализа.