Ассамблея и очистки прототип пенистый вирус Intasomes

Общая цель этой процедуры заключается в сборке и очистке прототипов пенистых вирусных интасом, которые затем могут быть использованы для биохимических, структурных и кинетических исследований. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ретровирусологии, такие как механика и динамика интеграции. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет выделять интеграционные комплексы, а не гетерогенную смесь веществ.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как восстановление и солюбилизация интеграционных комплексов имеют решающее значение для обеспечения оптимального выхода интасом. Для начала соедините 1XTEN буфер, 10 микромолярных олиго-1 и 10 микромолярных олиго-2 в конечном объеме 1,5 миллилитров. Затем аликвот 25 микролитров смеси на 60 0,2 миллилитров полимеразы меняют в реакционных пробирках.

Отжгите ДНК с помощью амплификатора с указанием времени и температуры, указанных в текстовом протоколе. После реакции объедините реакции отжига из всех 60 трубок. Затем загрузите 500 микролитров двух ультрацентробежных фильтров по 0,5 миллилира три килодальтоны с отсечкой молекулярной массы.

Концентрируйте отожженную вирусную ДНК путем центрифугирования в микроцентрифуге при температуре 14 000 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре. После удаления потока добавьте 250 микролитров оставшейся отожженной вирусной ДНК в каждую фильтрующую единицу. Повторяйте отжим, пока не останется примерно 50 микролитров, и откажитесь от потока.

Затем замените образец в TE-буфер, промыв три раза 450 микролитрами TE. После замены буфера переверните блок фильтра и вращайте при 1000 умноженных на g в течение двух минут при комнатной температуре. Итоговый остаточный объем для каждой фильтрующей установки должен составлять примерно 50 микролитров. Соедините ретентаты и переложите в 1,5-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой.

Наконец, измерьте поглощение вирусной ДНК в ультрафиолетовом диапазоне 260 нанометров, чтобы рассчитать концентрацию ДНК. Чтобы собрать интасомы, соедините 50 миллимолярных бис-трис пропана pH 7,5, 500 миллимоляров хлорида натрия, 120 микромолярной PFV интегразы и 50 микромолярной вирусной ДНК в общем объеме 150 микролитров. Очистите кусок диализа длиной 10 сантиметров диаметром от шести до восьми килодальтон диаметром от шести до восьми килодальтон и связанные с ним зажимы двойной дистиллированной водой или водой самой высокой чистоты.

Зафиксируйте один конец трубки, трижды промойте внутреннюю часть диализной трубки одним-двумя миллиметрами буфера для промывки. Удалите как можно большую часть буфера для полоскания с помощью пипетки и тонкого гелевого насадочного наконечника. Затем перенесите сборку интасомы на диализную трубку с помощью пипетки и тонкого гелевого наконечника.

Убедитесь, что узел выталкивается непосредственно в нижнюю часть диализной трубки. Зафиксируйте открытый конец диализной трубки, минимизировав количество воздуха, поступающего внутрь трубки. Затем поместите трубку в диализный буфер.

Диализируйте в течение ночи с помощью легких помешиваний, чтобы трубка вращалась, но не находилась в вихре. Убедитесь, что диализная трубка погружена в воду и подвижна. Примерно через час внутри трубки должен быть виден осадок.

Подготовьте два наконечника для пипеток с широким отверстием, удалив от двух до четырех миллилитров с конца наконечника объемом 200 микролитров с помощью новой бритвы или лезвия скальпеля на чистую поверхность. Извлеките диализную трубку из диализного буфера. Чтобы предотвратить разведение образца интасомы диализным буфером, который может остаться на конце трубки рядом с зажимом, используйте микропипетку с маленьким наконечником для пипетки для удаления избытка диализного буфера.

Снимите зажим с этого конца диализной трубки. При восстановлении сборки важно собрать как можно больше раствора и осадка. С помощью наконечника с широким отверстием для переноса образца вместе с осадком внутри диализной трубки в пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду.

Обратите внимание на общий объем извлеченного материала. Общий объем обычно составляет примерно 140 микролитров. Проба с осадком находится на 200 миллимолярах хлорида натрия.

Увеличьте концентрацию соли до конечной концентрации 320 миллимоляров хлорида натрия, добавив соответствующий объем пятимолярного раствора хлорида натрия. Перенесите ведро со льдом с образцом в холодную камеру с температурой четыре градуса Цельсия. Используйте наконечник пипетки с широким отверстием для повторного суспендирования и солюбилизации осадка путем пипетирования.

Повторяйте каждые 20 минут в течение как минимум одного часа. Большая часть осадка должна уйти в раствор. Чтобы очистить интасому, уравновесьте сшитую агарозную эксклюзионную хроматографию или колонку SEC с рабочим буфером SEC со скоростью потока 0,4 миллилитра в минуту.

Центрифугируйте образец интасомы в микрофуге при 14 000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить оставшийся осадок. После осторожного извлечения надосадочной жидкости загрузите ее в петлю для инъекций объемом 200 микролитров. Примените образец к столбцу SEC.

Разбавьте 25 миллилитров SEC беговым буфером и соберите 95 фракций по 270 микролитров. Обратите внимание, что на хроматограмме SEC отображаются три пика A280 и A260. Соедините по два микролитра каждой пиковой фракции интасомы в 50 нанограммах трехкилобазовой суперспиральной плазменной ДНК в реакционном буфере в конечном реакционном объеме 15 микролитров.

Также включите отрицательный контроль без добавления интасомы PFV. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Остановить реакцию можно с помощью 0,75 мкл протеиназы К и 0,75 мкл SDS.

Затем инкубируйте образец при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа. Далее добавьте три микролитра 50-процентного глицерина в каждую реакцию интеграции. Загрузите весь реакционный объем до одного процента веса на объем агарозного геля.

Кроме того, загрузите один микролитр маркера размера ДНК с 10 килооснованиями на дорожки по обе стороны от образцов. На внешней полосе загрузите шесть микролитров оранжевого красителя G. Запускайте гель при постоянном напряжении, 10 вольт на сантиметр, при температуре окружающей среды в течение одного часа или до тех пор, пока оранжевый перец красителя G не достигнет конца геля.

Немедленно визуализируйте агарозный гель с помощью флуоресцентного сканера, настроенного на обнаружение бромида этидия. На этом изображении должна быть показана согласованная интеграция в виде полосы, которая работает в соответствии с размером три килобазы. После количественной оценки полос на каждой полосе с помощью программного обеспечения для обработки изображений выберите дроби, которые имеют наиболее согласованную активность интеграции.

Распределите каждую фракцию по пять микролитров аликвот. Наконец, заморозьте аликвоты в жидком азоте перед хранением при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Показана репрезентативная хроматограмма очистки интасомной сборки PFV.

Видны три вершины. Центральный пик коррелирует с правильно собранными интасомами. Показана эффективность интегрирования в виде доли от пика центральной хроматографии.

Интасомы проверяли на активность без замораживания и с замораживанием и размораживанием. Замораживание и размораживание не показали различий в окрашивании аграозного геля бромида этидия в продуктах реакции интеграции. Здесь обозначены суперспиральный пластбид, продукты согласованной интеграции, продукты интеграции с полузрением и непрореагировавшая вирусная ДНК.

Количественная оценка эффективности интеграции по изображению бромида этидия также подтверждает, что после замораживания и размораживания не происходит потери интеграционной активности. Это обеспечивает длительное хранение. Молекула и положение метки влияют на эффективность сборки интасом PFV.

Немеченые интасомы и внутренняя метка Cy5 демонстрируют эквивалентную эффективность сборки. Однако концевая этикетка Cy5 или биотин снижают эффективность сборки. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как биохимический и одномолекулярный анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся интеграции, кинетики и динамики. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать, очищать и функционально оценивать интасомы PFV.