Иммунофенотипирование ортотопическая Homograft (сингенных) из мышиных первичной КЗК аденокарциномы поджелудочной железы протоковой подачей Cytometry

Это сообщение может помочь ответить на ключевые вопросы в иммунофенотипинге в моделях Murine, таких как маркеры, используемые для выявления различных линий иммунитета и стратегий старения. Основным преимуществом этого метода является то, что маркер и старение stategies, при иммунофенотипинге, могут быть применяться к различным моделям мурина. Мониторинг массы тела C57 Черный 6 мышей с помощью баланса.

Кроме того, контролировать объем опухоли опухоли различных мышей-доноров по калибру измерения. После эвтаназии животного в биоопасном капюшоне в соответствии с протоколом, стерилизовать кожу вокруг опухоли с помощью мазков Иодофора. После хирургического удаления опухоли, как описано в текстовом протоколе, поместите опухоль в чашку Петри, содержащую 20 миллилитров PBS, который был предварительно охлажден до 4 градусов по Цельсию.

Если есть загрязняющие крови, передать опухоль в другую чашку Петри и мыть опухоль с PBS. Разрежьте опухоль пополам. Удалите любую дополнительную кожу, сосуды, кальцификации и некроза.

Выберите только нетронутые кусочки опухоли и поместите их в стерильную 50-миллилитровую центрифугу. Добавьте 20 миллилитров PBS перед транспортировкой трубки в отдельную комнату для фармакологии. Чтобы подготовиться к ортопедической имплантации, зафиксируйте полностью анестезированной мыши на экспериментальной доске в правом боковом положении.

Дезинфицировать кожу вокруг селезенки с идодином, а затем де-йодинат с 75%этилового спирта. Найти среднюю точку селезенки и сделать 1 сантиметр вертикальный разрез на животе, чтобы разоблачить селезенки. Аккуратно вытянуть часть ткани поджелудочной железы под селезенку с помощью плоского кончика пинцета.

И сутро мыши гомотрансплантата опухоли кусок от мыши C на поджелудочной железе мыши-получателя 9-O bsorbable хирургический шов. Закройте брюшную полость 6-O шелковым швом двойным швом. Достичь гомеостаза путем сжатия.

После окончания имплантации опухоли, держать животное в теплой клетке до тех пор, пока не кровотечения или утечки опухолевых тканей происходит. Следите за животным до тех пор, пока они не обретут достаточное сознание для поддержания лежачих кормов. Верните животное в комнату животного после полного выздоровления от наркоза.

Мониторинг опухоли различных мышей путем пальпирования живота вблизи селезенки и выбрать мышей, несущих ортопедические опухоли. Для каждой опухоли подготовьтесь к одной трубке С с буфером пищеварения опухоли. Используйте 3 миллилитра буфера пищеварения для фрагментов опухоли менее 0,8 грамма, чтобы убедиться, что опухоль полностью переваривается.

Наклеить этикетку опухоли с кодом исследования, опухоли, мыши ID, группы лечения, и вес опухоли. Соберите опухоль с мыши. Вымойте опухоль в холодном PBS и очистить ткани, прикрепленные к опухоли.

Поместите опухоль в средства пищеварения в один колодец стерильной пластины 6-колодец. Держите опухоль на месте стерильными пинцетами или типсами и нарежьте скальпелем. Нарежьте опухоль достаточно хорошо, чтобы разбить на более мелкие кусочки.

Теперь поместите кусочки опухоли обратно в C-трубку и используйте оставшийся буфер пищеварения для мытья пластины. Перенесите жидкость в C-трубку и поместите ее на лед до пищеварения. Затем включите диссоциатор с обогревателями.

Поместите диссоциацию опухоли C-трубки вверх дном в рукав вакантного положения. Отрегулируйте состояние положения трубки от Свободного до Выбранного. Выберите программу диссоциации, следуют выбор требуемой папки, где отображается список программы.

После завершения программы свяжи C-трубку с диссоциатора и ненадолго закрутим, чтобы поддонировать образец. Теперь, повторно приостановить образцы и положить их в клетку ситечко выше 50 миллилитров трубки. Вымойте клетку через клеточный ситечко с 10 миллилитров буфера мытья, чтобы обеспечить одну подвеску клетки.

После центрифугирования трубки при 300 Г в течение 5 минут, отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки 5 миллилитров буфера стирки. Подсчитайте жизнеспособные клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на трубку или на образец. Выполните дизайн иммунной панели, иммуностимулятор и флуоресценцию минус один контроль в качестве детализации в текстовом протоколе.

Подготовка UltraComp шарики в то время как поток инструментов разогрева путем вихрей их тщательно перед использованием. Наклейте этикетку на отдельную 12 х 75 миллиметровую пробную трубку для каждого конъюгированных антител флюорохромов. Добавьте 100 микролитров буфера окрашивания в каждую трубку, следуют по одной полной капле бисера.

Добавить антитела и выполнить процедуру окрашивания, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте 0,5 миллилитра буфера окрашивания в каждую гранулу бисера и полностью переостановите через вихрь. Теперь установите цитометрию потока PMT напряжения на целевую ткань для данного эксперимента.

Вы запустите выборку через выборку через цитометрию потока для получения данных, набирая на однопалатную популяцию шарика на форвардный рассеяние и показания бокового рассеяния. Установите скорость потока около 200 до 300 событий в секунду. Установите соответствующую компенсацию за данный флуоресцентный FITC спряжения антител с помощью FL1 против FL1 точка участка.

Поместите квадрантные ворота так, чтобы отрицательные бусы были в левом нижнем квадранте, а положительные бусинки находятся в верхнем или нижнем правом квадранте. Отрегулируйте значения компенсации до тех пор, пока средняя интенсивность флуоресцентных данных каждой популяции не будет примерно равной. Повторите эти шаги для всех трубок.

Теперь приступайте к приобретению фактических образцов пятен. Запустите мастер компенсации и сохраните настройки с форматом:дата, эксперимент и ваши инициалы. Ортопедическая имплантация аденокарциномы протоков поджелудочной железы привела к быстрому росту опухоли, аналогичному тому, что наблюдается при подкожной имплантации.

Показаны репрезентативные изображения окрашивания гематоксилина и эозин и демонстрируется аналогичный рост подкожных и ортопедических имплантатов. Разумно высокие жизнеспособные выходы клеток были получить из образца опухоли обоих типов имплантации. Представитель FACS splat показывает жизнеспособные клетки от опухоли, отделенной от мертвых клеток и клеточного мусора.

Показано здесь, является опухоль проникает иммунного профиля сравнения основных и числительной клеточной популяции нескольких ключевых подмножего опухолевых иммунных клеток. Показаны подкожные против ортопедического гомотрансплантата рака поджелудочной железы. Данные ясно показывают, что опухоль значительно увеличить инфильтрацию иммунных клеток по сравнению с поджелудочной железой здоровых мышей.

Кроме того, различные проценты опухоли проникновения подмножества иммунных клеток были найдены в ортопедических по сравнению с подкожными гомотрансплантами. Например, в ортопедических клетках значительно больше В, чем в подкожных. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы подготовить все связанные материалы и реагенты заранее.

После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнить анализ FACS для моделей murine.