Обнаружение Инфламмасома активации и Pyroptotic клеточной гибели в мышиных макрофагов, костного мозга, полученных

Общие цели этого протокола заключаются в изучении активации инфламмасом на уровне отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и измерении лизиса во время пироптоза с помощью анализа лактатдегидрогеназы или высвобождения ЛДГ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инфламмасом, например, как регулируется активация каспазы-1. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют пользователю исследовать несколько этапов пути активации инфламмасом и пироптоза.

Демонстрировать процедуру будет Андреас ден Харти, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с замены среды из макрофагов, полученных из ЛПС-праймированного костного мозга, засеянных на стеклянные покровные стекла, 290 микролитрами среды DMEM 5 с добавлением пяти микромолярных нигерицинов и пяти миллимолярных глицинов на лунку. Верните 24-луночный планшет в инкубатор для клеточных культур на 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, добавив 10 микролитров 30X FAM-YVAD-FMK через первые 15 минут.

В конце инкубации промойте клетки одним миллилитром холодного PBS на лунку, три раза в течение пяти минут на промывку и зафиксируйте клетки 250 микролитрами 2%-ного параформальдегида на лунку на 30 минут на льду, защищенном от света, пометив клетки соответствующим флуоресцентным ядерным красителем в течение последних пяти минут. В конце инкубации трижды промойте ячейки холодной PBS, как показано только что на рисунке, и загрузите на каждое предметное стекло семь микролитров монтажной среды, препятствующей выцветанию. Поместите покровное стекло на каждую заслонку и дайте монтажной среде застыть в течение ночи, прежде чем заклеивать покровные стекла лаком для ногтей.

Чтобы получить изображение клеток с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии, поместите необработанное контрольное предметное стекло на предметный столик микроскопа и вручную сфокусируйтесь на клетках. Используя настройки таблицы поиска микроскопа, регулируйте смещение до тех пор, пока в необработанных клетках не будет наблюдаться положительное окрашивание зондом. Затем, используя образец, обработанный нигерицином, найдите поле, содержащее клетки, которые являются как положительными, так и отрицательными для окрашивания зондом, и настройте плоскость визуализации канала зонда на плоскость с самой высокой интенсивностью положительного окрашивания.

Затем регулируйте усиление до тех пор, пока в ячейках с конденсированными ядрами не станут видны очаги и получайте изображения пяти случайно выбранных полей на слайде при 100-кратном общем увеличении. Для иммунофторхимического анализа клеток, обработанных нигерицином, промойте помеченные проповинцией клетки, как только что продемонстрировано, и инкубируйте клетки в 250 микролитрах раствора фиксации и пермеабилизации на лунку в течение 30 минут на льду, защищенном от света. Промойте макрофаги еще три раза свежим буфером для промывки и пометьте клетки 250 микролитрами первичного антитела против связанного с птозом пятнистовидного белка, содержащего С-концевой домен рекрутирования каспазы, или ASC, на лунку, в течение одного часа на льду.

Промойте клетки в конце инкубации и пометьте образцы 250 микролитрами соответствующего конъюгированного флуоресцентного красителя вторичного антитела в течение еще одного часа на льду, добавив четыре микролитра соответствующего флуоресцентного ядерного окрашивающего красителя в течение последних пяти минут. После трехкратной промывки клеток в буфере холодной промывки установите покровные стекла на предметные стекла с семью микролитрами антивыцветающей монтажной среды, как показано, и визуализируйте макрофаги с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. Для проведения анализа высвобождения ЛДГ в каждую экспериментальную лунку добавляют 50 микролитров среды DMEM 5 с добавлением 10 микромолярного нигерицина и 50 микролитров DMEM 5 в контрольные лунки для спонтанного и 100%-ного лизиса в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе.

Через 30 минут добавьте 10 микролитров 10-кратного буфера для лизиса в контрольные лунки 100% лизиса и добавьте 10 микролитров среды в остальные лунки. По окончании инкубации центрифугируйте планшет и переведите по 50 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки на чистую пластину с плоским дном. Далее добавьте в каждую лунку по 50 микролитров свежеразмороженного и подготовленного субстрата для 30-минутной инкубации в темноте, проверяя пластину через 15 минут, чтобы убедиться, что сигнал не превысит предел обнаружения считывателя пластин.

В конце инкубации добавьте 50 микролитров стоп-раствора в каждую лунку и измерьте OD490 на соответствующем планшетном ридоре, чтобы можно было рассчитать процент лизиса клеток на лунку. В то время как типовые макрофаги, подвергшиеся воздействию нигерицина, демонстрируют образование очага ASC в перинуклеарной области, который также содержит активные каспазы-1, что указывает на то, что эти клетки подвергаются пироптозу. В то время как макрофаги мышей с дефицитом каспазы-111 также генерируют фокус ASC, эти клетки не имеют активной каспазы-1, связанной с этим очагом, на что указывает отсутствие окрашивания FAM-YVAD-FMK.

Ядра этих клеток также не конденсированы, что указывает на отсутствие пироптотической гибели клеток. Кроме того, большой процент макрофагов дикого типа подвергается гибели клеток после воздействия нигерицина, что измеряется анализом высвобождения ЛДГ их культуральными надосадочными зонтами, в то время как макрофаги с дефицитом Каспазы-1 не высвобождают ЛДГ в надосадочную жидкость, что указывает на то, что клетки все еще неповреждены. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать образование инфламмасом с помощью флуоресцентной микроскопии и определить уровень лизиса клеток путем измерения высвобождения ЛДГ.

Эта процедура может быть модифицирована для использования других инфламмасомных стимулов или вмешательств, которые изменяют активацию инфламмасом или пироптоз.