Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Общая цель этого эксперимента заключается в определении специфичности протеазы в нескольких сырых экстрактах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы для определения специфичности протеазы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выявлять специфичность протеазы нескольких образцов в экспрессе.

Холодные образцы легочной ткани, полученные от самцов мышей ICR во льду. Гомогенизируйте образцы при 20 000 RMP в течение 30 секунд в блендере. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока образцы не станут полностью однородными.

Не гомогенизируйте более одной минуты непрерывно во избежание повышения температуры. Перелейте 1 000 микролитров гомогената в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 10 000 раз G при четырех градусах Цельсия. Перелейте 500 микролитров надосадочной жидкости в новую пластиковую трубку объемом 1,5 миллилитров.

Используйте 10 микролитров образца для определения концентрации белка. Использование таких методов, как анализ на бицинхониновую кислоту или анализ Брэдфорда. Чтобы предотвратить замерзание, добавьте в образцы 80% глицерина до конечной концентрации 50% глицерина.

Чтобы уточнить разницу в специфичности протеазы в зависимости от pH, используйте буферы для пищеварения, скорректированные на pH 3, 5, 7 и 9. В 890 микролитров буфера для пищеварения добавьте либо 10 микролитров 0,1 микрограмма на микролитр или трипсина TPCK, либо 0,1 микрограмма на микролитр протеазы золотистого стафилококка V8 или 10 микрограммов на микролитр тканевых экстрактов. Приготовьте отрицательный контроль путем инактивации протеазы в тканевых экстрактах путем инкубации и кипячения воды в течение 10 минут.

Затем добавьте в образцы 10 микролитров субстратов для меток биотина MNO и инкубируйте в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия для переваривания. После инкубации остановите сбивание субстратов кипятком на 10 минут. Центрифугируйте сваренные субстраты в течение пяти минут при температуре 10 000 раз G при четырех градусах Цельсия.

Переложите надосадочную жидкость в новую трубку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 50 мл 50% стрептавидина сефарозных гранул в один молярный трис-буфер, содержащий 0,1% полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. Используйте бумагу для проверки pH, чтобы убедиться, что уровень раствора составляет около девяти pH.

Важно отрегулировать правильный pH до девяти и более. Аминобиотин не может укусить бусину, если pH не составляет девять или выше. Если pH раствора низкий, отрегулируйте его примерно до pH девяти, добавив больше буфера.

Кроме того, при необходимости можно добавить один молярный трис-буфер для повышения pH. Инкубируйте суспензию в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с непрерывным бережным перемешиванием на вращательном колесе, чтобы связать субстраты, меченные биотином MNO, со стрептавидином. Бусины должны оставаться подвешенными на протяжении всей инкубации.

На следующий день центрифугируйте образцы в течение одной минуты при температуре 10 000 G при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости промойте шарики, добавив 1 000 микролитров буфера для стирки. Затем инкубируйте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия с непрерывным аккуратным перемешиванием на ротаторе.

Центрифугируйте шарики в течение одной минуты при температуре 10 000 раз G при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторите эту стирку четыре раза. Далее добавьте в бусины 100 микролитров 0,2% трифторуксусной кислоты.

Используйте бумагу для проверки pH, чтобы убедиться, что уровень раствора ниже pH два. Если pH раствора высокий, отрегулируйте pH до уровня ниже двух, добавив 1% трифторуксусную кислоту. Инкубировать суспензию в течение 30 минут при комнатной температуре при непрерывном бережном перемешивании на вращающемся колесе.

После центрифугирования шариков, как и раньше, переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Нанесите 20 микролитров ацетонитрила на смолу C18, чтобы активировать его. Удалите использованный ацетонитрил и повторите этот шаг активации три раза.

Затем уравновесьте смолу C18 с 20 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты. Удалите элюант и повторите этот шаг уравновешивания три раза. Чтобы загрузить образцы, свяжите их со смолой с помощью пипетки.

Промойте смолу 20 микролитрами 0,1% трифторуксусной кислоты. Повторите этот шаг пять раз. Разбавьте образцы тремя микролитрами 60%-ного ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте.

Пипетирование элюанта на целевой пластине для масс-спектрометрии MALDI-TOF. Сразу же добавьте раствор CHCA, насыщенный 50% ацетонитрилом в 0,1% трифторуксусной кислотой. Кристаллизуйте смесь путем сушки на воздухе.

Получить масс-спектры образцов можно в соответствии с протоколом производителя прибора, уделяя пристальное внимание масс-спектрам от 700 до 900 дальтон для расщепленной формы подложек биотиновых меток. Здесь представлены масс-спектры синтетических подложек. Пики, соответствующие молекулярной массе предшественника, были обнаружены в диапазоне от 850 до 1050

Отколовшиеся осколки обнаруживаются в диапазоне от 700 до 850. Здесь показаны спектры субстратов, меченных биотином MNO, обработанных трипсином TPCK. Пики 839,81 дальтона и 796,76 дальтона соответствуют фрагментам, отколовшимся от С-конца лизина и аргинина соответственно.

Здесь представлены масс-спектры синтетических субстратов, расщепленных протеазой V8. Пики 769,78 дальтона и 755,62 дальтона соответствуют фрагментам, отколовшимся от С-конца глутаминовой и аспарагиновой кислот соответственно. Здесь представлены спектры субстратов меток биотина MNO, обработанных экстрактом легочной ткани при различных условиях pH.

В кислом состоянии, при рН 5, молекулярная масса расщепленного фрагмента составила 770,13 дальтон и 826,66 дальтон, что указывает на расщепление глутаминовой кислоты и триптофана на С-конце. В нейтральном и основном состоянии, при рН 7 и 9, молекулярная масса расщепленного фрагмента увеличивалась на пике 767 дальтон и 840 дальтон, что указывает на расщепление на С-конце аргинина и лизина. И наоборот, пики глутаминовой кислоты и триптофана были снижены.

Кроме того, этот метод не может обнаружить расщепленные фрагменты с инактивированными экстрактами. После освоения эта техника может быть выполнена за два дня, если она выполнена правильно, за исключением синтеза субстрата. Кроме того, после синтеза субстрата его можно измерить в нескольких образцах. Почему?

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нужно работать при буферном рН, около девяти. В целом, реакция авидина на аминобиотиновый комплекс. После этой процедуры можно количественно оценить активность фермента с помощью CMS.

Этот метод позволит исследователям в области протеонов проложить путь к изучению экспрессии протеазы в нескольких условиях.