Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи

Общей целью данной процедуры является определение взаимосвязи между образованием внутриклеточных белковых агрегатов и их влиянием на клеточный окислительный стресс с помощью пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием и агрегацией белка, таких как нейродегенеративные расстройства и ненейропатические амилоидозы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост, быстр и позволяет количественно оценить повреждение клеточного окислительного стресса в большой популяции дрожжей.

С помощью этого метода мы можем получить представление о корреляции между внутриклеточным растворимым или агрегированным состоянием амилоидогенного белка и уровнями окислительного стресса в дрожжах. Кроме того, он также может быть применен к другим модельным организмам, экспрессирующим рекомбинантные белки. Анализ проточной цитометрии будет демонстрировать Мануэла Коста, техник из Центра проточной цитометрии UAB.

В этом исследовании состояние внутриклеточной агрегации различных вариантов пептида A-бета-42 отслеживается с помощью S.cerevisiae, преобразованного плазмидой, кодирующей A-бета-42, слитой с GFP под контролем галактозоиндуцируемого промотора. Выберите одну колонию трансформированных дрожжевых клеток и внесите 20 миллилитров среды SC минус Ura, содержащей 2% глюкозы. Выращивайте культуру при температуре 30 градусов Цельсия под перемешиванием в течение ночи.

На следующий день инокулируйте 100 микролитров ночной культуры в пять миллилитров свежей среды SC минус Ura и выращивайте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех часов. Когда оптическая плотность культуры составляет 590 нанометров или OD 590 0,5, центрифугируйте культуру при 3000 g в течение четырех минут, отбрасывайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах свежей среды SC минус Ura, содержащей 2% рафинозы. Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия при перемешивании в течение 30 минут.

Через 30 минут центрифугируйте клетки при 3000 g в течение четырех минут, отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в свежей среде SC минус Ura, содержащей 2% галактозы, чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного белка. Верните клетки в инкубатор на 16 часов. Через 16 часов соберите клетки, переложив одномиллилитровые аликвоты культуры в стерильные микроцентрифужные пробирки и центрифугируя при 3000 г в течение четырех минут.

Начните эту процедуру с определения OD 590 16-часовых индуцированных дрожжевых клеток. Затем разбавьте клетки в стерильном PBS до OD 590, равного 0,1. Перенесите суспензии экспрессирующих клеток в полистирольные пробирки с круглым дном и защитите их от света.

Подготовьте неиндуцированные клетки в качестве отрицательного контроля для анализа проточной цитометрии. Добавьте зонд окислительного стресса к каждому образцу в конечной концентрации пять микромоляров. Накройте образцы алюминиевой фольгой, и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Когда инкубация будет завершена, раскрутите клетки, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в PBS. Трижды промойте камеры таким образом с помощью PBS. После третьей промывки повторно суспендируйте клетки в прежнем объеме PBS.

Убедитесь, что неокрашенные клетки включены в анализ проточной цитометрии. Используя соответствующие лазеры и фильтры, проведите анализ проточной цитометрии для обнаружения GFP и флуоресцентного сигнала зонда окислительного стресса. Начните с того, что нажмите на панель «Открыть новый лист» и дайте эксперименту название.

На панели инструментов выберите инструмент «Точечная диаграмма» и создайте график с переменными «Боковая область рассеяния» по оси «Y» и «Прямая область рассеяния» в линейном масштабе по оси X. Щелкните инструмент Точечная диаграмма (Scatter Plot) и создайте график с переменными FITC Area на оси x и APC Area в логарифмическом масштабе по оси y. Нажмите на значок «Настройка прибора» и установите все уровни компенсации в нулевое значение на вкладке «Компенсация».

Затем перейдите на вкладку «Сбор» и выберите общее количество 20 000 событий, которые будут записаны с низкой скоростью потока. Поскольку сигнал флуоресцентного излучения одного флуорохрома может быть обнаружен другим детектором, важно выполнить процесс компенсации для выравнивания минимального сигнала каждого флуорохрома во всех детекторах с помощью одноцветного управления. Переименуйте трубку 001 в отрицательный контроль и перейдите на вкладку «Захват», чтобы начать запуск неиндуцированных, неокрашенных клеток.

Отрегулируйте напряжение в настройках прибора для прямого и бокового разброса до тех пор, пока население не будет распределено в среднем левом квадранте. Нажмите на значок Полигон, чтобы установить область R1 вокруг популяции клеток, исключая клеточный мусор, и используйте эту закрытую популяцию P1 равной R1 для всех флуоресцентных точечных графиков и представлений гистограмм. Чтобы отрегулировать напряжение ФЭУ флуоресцентного сигнала, запустите неокрашенные ячейки на точечной диаграмме от FL1 до FL3, настраивая усиление на вкладке Instrument Setting (Настройка прибора), пока ячейки не будут распределены в нижнем левом квадранте.

С помощью инструмента «Точечная диаграмма» создайте точечную диаграмму с переменными FITC-A по оси x и вторую точечную диаграмму с переменными APC-A по оси x и FSC-A. Далее поменяйте образец на индуцированные клетки, чтобы измерить флуоресценцию GFP. На вкладке Instrument Setting (Настройка прибора) установите усиление в зависимости от FSC-A в зависимости от FITC, когда население распределено в нижнем правом квадранте.

Определите популяцию GFP-положительных клеток с помощью вентиля. Замените образец на неиндуцированные окрашенные клетки. Отображение окислительного стресса с помощью флуоресценции на точечной диаграмме FSC-A в сравнении с APC-A.

Настраивайте усиление до тех пор, пока популяция клеток не будет распределена в левом верхнем квадранте. Затвор положительной клеточной популяции в P3. С помощью значка Гистограмма (Histogram) создайте два графика гистограммы для отображения флуоресценции клеток: один для FITC и другой для флуоресценции APC. Создайте таблицу, отображающую среднюю интенсивность флуоресценции и медиану флуоресценции с соответствующей стандартной ошибкой и/или коэффициентом дисперсии для уровней флуоресценции GFP и окислительного стресса.

Перейдите на вкладку Компенсация и установите все уровни компенсации равными нулю. Перейдите на вкладку «Приобретение» и выберите общее количество 20 000 событий для записи. Подготовьте три новые пробирки с образцами и назовите их «неиндуцированные», «индуцированные растворимые» и «индуцированные агрегированные».

Получение данных из образцов с предустановленными настройками. Проанализируйте данные, открыв новый лист и создав точечную диаграмму для переменных FITC-A и APC-A, определив положительные ячейки для окрашивания CellROX. Для каждого образца создайте таблицу статистики со средним значением флуоресценции и стандартной погрешностью для каналов FITC и APC.

Также возможна сортировка клеток с помощью сортировщика FACS после подсчета агрегированных белков. Дрожжевые клетки, экспрессирующие варианты A-бета-42 после периода индукции в течение 16 часов, визуализируются под флуоресцентным микроскопом для определения распределения рекомбинантных белков внутри клеток. Эти изображения являются репрезентативными для выбранных вариантов A-beta-42 GFP.

Образование белковых включений, или ПИ, было подтверждено в 10 из 20 вариантов из анализируемой коллекции. Эта гистограмма показывает процент клеток, содержащих разное количество PI, рассчитанный из 500 флуоресцентных клеток для каждого варианта в биологические реплики. Наблюдалось отличное соответствие между предсказанными и in vivo свойствами агрегации.

Уровни экспрессии белка в клеточных экстрактах количественно определяли с помощью А-бета-специфического антитела. Как общая тенденция, PI-образующие варианты A-бета-42, окрашенные в зеленый цвет, присутствуют на более низких уровнях, чем те, которые диффузно распределены в цитозоле, окрашенном в красный цвет. Важные различия между вариантами A-бета-42 наблюдались при представлении их флуоресценции зонда окислительного стресса, уровней белка и флуоресцентных свойств GFP относительно их способности образовывать PI и их внутренней склонности к агрегации, предсказанной с помощью биоинформатического алгоритма AGGRESCAN или TANGO.

Варианты, образующие PI, выделены зеленым цветом, а варианты, не образующие PI, — красным. После этой процедуры также могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание йодидом пропидиума или аннексином V, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение влияния внутриклеточного экспрессируемого варианта белка на клеточный апоптоз или цитотоксичность.