Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

Общая цель данного препарата для библиотеки CDNA состоит в том, чтобы обеспечить успешное секвенирование малых РНК, которые хранились в формальных и фиксированных тканях, залитых парафином. Этот метод очень полезен для анализа формальных и фиксированных образцов, залитых парафином. Вы извлекаете РНК из 18 образцов, анализируете их содержание и получаете профиль всей микроРНКазы для всех образцов.

Чтобы начать протокол, добавьте 8,5 микролитров заранее приготовленной мастер-смеси для лигирования в каждый из 18 индивидуально аликвотированных образцов FFPERNA. Аккуратно переверните пробирки и центрифугируйте в течение двух секунд. После центрифугирования пробирки хранить на льду.

Используйте пипетку объемом три микролитра, чтобы передать по одному микролитру каждого адаптера в соответствующие образцы FFPERNA, содержащие РНК и мастер-смесь лигирования. Не проводите пипетку вверх и вниз и не меняйте наконечники между образцами FFPERNA. Закройте каждую пробирку, перемешайте их и центрифугируйте в течение двух секунд.

Установите трубки на лед. Денатурируйте реакции, поместив пробирки на термоблок при температуре 90 градусов Цельсия на одну минуту, а затем сразу же поместите их на лед. Затем с помощью пипетки объемом три микролитра переведите по одному микролитру разбавленного фермента лигирования в каждый из 18 образцов РНК.

Установите перевязки на лед и поместите их в холодную камеру при температуре 4 градусов Цельсия для ночной инкубации в течение 18 часов. Поместите трубки на тепловой блок на одну минуту при температуре 90 градусов Цельсия, чтобы деактивировать реакцию лигирования, а затем верните их на лед не менее чем на две минуты для охлаждения. Переложите по 1,2 микролитра мастер-смеси для осадков в каждую пробирку.

Добавьте 63 микролитра 100% этанола. Закройте каждую пробирку, перемешайте пробирки и центрифугируйте их в течение двух секунд. Поместите трубки на лед.

Соедините содержимое всех 18 пробирок в одну силиконизированную пробирку объемом 1,5 миллилитра и переверните три раза для перемешивания. Центрифугируйте пробирки в течение двух секунд и поместите их на лед на 60 минут для осаждения. После осаждения центрифугируйте пробирку объемом 1,5 миллилитра с объединенными лигациями.

Затем удалите надосадочную жидкость с помощью наконечника для пипетки объемом в один миллилитр, но оставьте немного жидкости на дне. Наклоните трубку и с помощью пипетки объемом 20 микролитров удалите остатки надосадочной жидкости. Вакуумируйте надосадочную жидкость с помощью пастеровской пипетки с наконечником объемом 10 микролитров, затем повторно суспендируйте гранулу РНК в 20 микролитрах воды, не содержащей РНКазы, щелкнув пробиркой.

Добавьте 20 микролитров раствора для загрузки геля ПАА для ресуспендирования РНК. Переверните пробирку, центрифугируйте пробирку в течение двух секунд при комнатной температуре и поставьте пробирку на лед. Замените ранее приготовленные 0,5 XTBE гелевого аппарата на свежие 0,5 XTBE, а в центр геля загрузите последний, маркеры размера и лигированную РНКазу, оставив по две пустые лунки с обеих сторон.

Затем запустите гель. После запуска геля разлите 15%-ную страницу, удалив одну из стеклянных пластин. Слегка распылите гель, сидящий на стеклянной пластине, с 10 микролитрами раствора флуоресцентного красителя и 25 миллилитрами 0,5 XTBE, и оставьте на пять минут в темноте.

Положите стакан с гелем на трансиллюминатор синего света и совместите маркеры размера 19 нуклеотидов и 24 нуклеотида с помощью линейки, чтобы направить иссечение лигированных малых РНК. Затем вырежьте гель. Поместите вырезанный гель в пробирку объемом 0,5 миллилитров, предназначенную для фрагментации срезов геля, надежно расположенную в силиконизированной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте гель при 16 тысячах G в течение трех минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте фрагментированный гель 300 микролитрами 400 миллимолярного раствора хлорида натрия. Закройте трубку, и запечатайте ее парафиновой пленкой.

Перемешайте содержимое на термомиксере при 11 сотнях об/мин в холодильной камере при температуре четыре градуса Цельсия для ночной инкубации. На следующий день извлеките пробирку из термомиксера и с помощью одномиллилитровой пипетки переведите раствор на пятимикрометровую пробирку с фильтром, вставленную в 1,5-миллилитровую силиконизированную пробирку для сбора РНКазы. Центрифугируйте пробирку в течение трех минут при температуре 23 ста G при комнатной температуре.

Выбросьте трубку фильтра, добавьте 950 микролитров 100% этанола в сборную трубку, содержащую отфильтрованный раствор, и переверните трубку для перемешивания. Центрифугируйте пробирку в течение двух секунд, и поместите ее на лед на 60 минут. Затем осадите гранулу РНК.

Далее высушите гранулу РНК, открыв крышку и осторожно удалив надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом в один миллитр, оставив при этом немного жидкости на дне. С помощью пипетки объемом 20 микролитров удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость, не прикасаясь к грануле. Наклоните трубку так, чтобы оставшийся раствор переместился на противоположную сторону гранулы.

Используйте пастеровскую пипетку для аспирации надосадочной жидкости и высушите гранулу с помощью вакуума. Ресуспендируйте гранулу РНК в 5,6 микролитрах воды, не содержащей РНКазы. Разморозьте реактивы обратной транскрипции на льду в течение 15 минут.

Настройте реакцию обратной транскрипции, добавив три микролитра 5X буфера, 4,2 микролитра 10X диоксинуклеотидтрифосфата, или DNTP, и 1,5 микролитра дитиотреита, или DTT. Осторожно переверните пробирку, чтобы смешать реакцию, и центрифугируйте в течение двух секунд, чтобы собрать раствор. После того, как реакция продлится на термоблоке при температуре 90 градусов Цельсия ровно 30 секунд, перенесите его непосредственно в термомиксер при температуре 50 градусов Цельсия на две минуты, чтобы выровнять температуру.

Добавьте 0,75 микролитра фермента обратной транскрипции непосредственно в раствор. Осторожно перемешайте и сразу же установите трубку обратно на термомиксер при температуре 50 градусов Цельсия на 30 минут. Через 30 минут перенесите трубку в нагревательный блок при температуре 95 градусов Цельсия на одну минуту, чтобы остановить обратную транскрипцию.

Добавьте 95 микролитров воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в обратную транскрипцию. Перемешайте тюбик и поставьте его прямо на лед на две минуты. Соберите пилотную ПЦР-реакцию и настройте два цикла ПЦР на термоамплификаторе.

Настройте пилотную ПЦР-реакцию на термоамплификаторе и запустите файл один. В конце первого файла с помощью пипетки объемом 20 микролитров переведите 12 микролитров из пилотной ПЦР-реакции в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую три микролитра гелеобразующего красителя 5X. Перемешайте пипеткой вверх и вниз.

И промаркируйте его на 10 циклов. Закройте пилотную пробирку для ПЦР и запустите файл два на термоамплификаторе. В конце второго файла с помощью пипетки объемом 20 микролитров переведите 12 микролитров раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров с тремя микролитрами гелеобразного красителя 5X и промаркируйте ее на 12 циклов.

Повторите описанные выше шаги, чтобы собрать 12 микролитров продуктов ПЦР из пилотной ПЦР-реакции на циклах ПЦР 14, 16, 18 и 20. Затем добавьте по три микролитра гелеобразного красителя 5X к каждому из 12 микролитров аликвот ПЦР, а также к 20 нуклеотидным трапу, содержащим три микролитра трапа и девять микролитров воды, не содержащей РНКазы. После прогона образцов на агарозном геле с 0,5 XTBE оцените гель на УФ-боксе, чтобы определить оптимальный цикл ПЦР.

Затем настраиваются масштабные ПЦР-реакции для очистки библиотеки агарозного геля. После амплификации ПЦР перелейте девять микролитров из каждой ПЦР-пробирки в шесть микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 миллилитров, содержащих три микролитра гелеобразного красителя 5X. Подготовьте лестницу на 20 нуклеотидов.

Загрузите лестницу, отрицательный контроль ПЦР и шесть продуктов ПЦР на агарозный гель и запустите гель в течение 30 минут при напряжении 120 вольт. Проверьте однородность импликаторов ПЦР между полосами на УФ-боксе и сделайте снимок. Соедините три ПЦР-реакции в двух силиконизированных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров, добавьте 27 микролитров пяти моляров хлорида натрия и 950 микролитров 100% этанола.

Переверните пробирки для перемешивания и установите их при температуре 20 градусов Цельсия на ночь, чтобы продукты ПЦР выпали в осадок. С помощью протокола была установлена корреляция экспрессии микроРНК между двумя свежезамороженными опухолевыми РНК и их специфическими аналогами из образца FFPERNA. Графики между совместимыми свежезамороженными микроРНК и микроРНК FFPE указывают на то, что препарат библиотеки CDNA обеспечивает хорошую воспроизводимость, поскольку существует высокая корреляция между микроРНК, обнаруженными в образцах, обработанных по-разному.

Чтобы определить, применим ли оптимизированный протокол подготовки CNDA Library и воспроизводим ли его на все более старых образцах FFPE, были получены профили экспрессии микроРНК из тканей FFPE, архивированных за 18, 20, 22, 27, 30 и 35 лет. Коэффициент корреляции оставался выше 0,96 независимо от возраста образца или недели подготовки к библиотеке. Таким образом, оптимизированный протокол подготовки библиотеки CDNA предоставляет надежный инструмент для воспроизводимого анализа образцов FFPE, независимо от времени их архивирования.

Таким образом, после просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить малые библиотеки РНК и получить полный профиль микроинэкспрессии всех ваших драгоценных формальных и фиксированных образцов, залитых парафином.