Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков
5 сентября 2018 г.
По множеству признаков болезни более физиологически соответствующих моделей в настоящее время разработана и реализована в наркотики discovery программ. Новой модели системы, описанные здесь показано как трехмерные опухоли сфероидов может быть культивировали и показан в высок объём 1536-ну пластины системы для поиска новых онкологических препаратов.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарств, такие как то, какие условия культуры тканей являются наиболее подходящими для идентификации попадания в свинец. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет культивировать клетки в трех измерениях, с высокой пропускной способностью, используя 1536 луночных планшетов. Демонстрировать этот протокол будет Кальяни Гампа, старший научный сотрудник моей лаборатории.
Чтобы создать 3D-культуру сфероидов опухоли, отсоедините интересующие линии раковых клеток с помощью трех смывов BBS. Далее следует добавление одного миллилитра трипсина на пять квадратных сантиметров площади культуральной колбы. Через пять минут нейтрализуйте трипсин с помощью пятикратного объема сывороточной среды, добавленной в каждую колбу, и подсчитайте клетки.
Используйте стерилизованную небольшую кассету с наконечником из нержавеющей стали с перистальтической системой на основе насоса, чтобы засеять в общей сложности 500 клеток в восьми микролитрах сфероидной среды в каждую лунку 1536-луночного планшета, обработанного тканевой культурой. Затем используйте дышащий клейкий уплотнитель, чтобы закрыть пластину. И поместите тарелку во вращающийся инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия и 10 оборотов в минуту с 5% углекислым газом и относительной влажностью 95% на три дня.
Самым важным шагом является обеспечение хорошей герметизации пластин перед их помещением в инкубатор. Сфероидам потребуется три дня для формирования, и этот этап предотвращает испарение среды. В конце инкубации быстро вращайте выстланные раком культуральные планшеты под давлением, в 100 раз превышающим силу тяжести, чтобы собрать конденсат, и снимите адгезивные пломбы.
Поместите каждую обрабатываемую пластину на акустический дозатор, настроенный на подачу в общей сложности восьми нанолитров каждого соединения. Разбавление до конечной концентрации 0,1% ДМСО на лунку и верхней комбинированной дозы 10 микромоляров. Когда соединение будет добавлено в соответствующие тарелки, поместите на каждую пластину изготовленную на заказ крышку для клеточной культуры из нержавеющей стали, чтобы предотвратить испарение, и верните пластины в вращающийся инкубатор еще на пять дней.
В конце инкубации добавьте три микролитра предварительно подогретого реагента для лизиса клеток, дополненного люциферином, в каждую лунку каждой пластины для культивирования клеток. И инкубировать пластины при комнатной температуре не менее 15 минут. Затем зарегистрируйте люминесце АТФ на пластинчатом люминометре.
Когда все планшеты будут проанализированы, извлеките исходные данные из прибора и нормализуйте все поля, содержащие исследуемые соединения, до среднего значения по всем скважинам, содержащим только ДМСО в качестве нейтрального контроля. Затем в соответствии с формулой можно рассчитать процентное ингибирование роста каждого соединения, а также создать кривые реакции на дозу и ингибиторные IC50. Разнообразие укоренившихся раковых клеток, которые, как известно, хорошо растут в условиях 2D-культивирования, также сформировали 3D-структуры при культивировании, как только что продемонстрировано, несмотря на их морфологические различия.
При использовании для крупномасштабного скрининга можно наблюдать дифференциальную чувствительность к соединениям между культурами, выращенными в 2D, и культурами, выращенными в 3D. Каждая точка представляет собой ингибиторную концентрацию одного соединения, для которого наблюдается 50%-ный ответ на уничтожение клеток в обоих условиях культивирования. В этом репрезентативном эксперименте оба тестируемых ингибиторных соединения RAF-киназы оказались более мощными в 3D-условиях в культуре линии немелкоклеточного рака легких, содержащей активирующую мутацию в белке KRAS.
Тем не менее, соединения демонстрируют аналогичную активность как в 3D сфероидах, так и в культурах 2D линии рака толстой кишки, которые содержат активирующую мутацию G13D в KRAS. 3D-анализ также позволяет наблюдать парадоксальный феномен активации роста, который происходит при неполном ингибировании димеров RAF в высокоактивированных мутантных линиях RAFs, о чем свидетельствует рост клеток при низких концентрациях препарата, который подавляется при высоких концентрациях. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области разработки лекарств от рака для изучения альтернативных условий культивирования для идентификации нового, эффективного химического вещества против известных мишеней.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен новый метод поиска лекарственных средств с использованием трехмерных опухолевых сфероидов, культивируемых в высокопроизводительной системе планшетов на 1536 лунок. Этот подход направлен на повышение релевантности условий культивирования тканей при идентификации потенциальных онкологических препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Разработка лекарственных препаратов
- Методы культивирования клеток
Теоретические сведения
- Традиционные двухмерные клеточные культуры часто не способны имитировать микроокружение опухоли.
- Трехмерные культуры представляют собой более физиологически релевантную модель для изучения рака.
- Высокопроизводительный скрининг необходим для эффективного поиска лекарственных средств.
- Данное исследование сосредоточено на оптимизации культивирования опухолевых сфероидов.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод культивирования опухолевых сфероидов.
- Оценить применимость данной модели в поиске новых лекарственных препаратов.
- Способствовать идентификации новых противоопухолевых препаратов.
Используемые методы
- Отсоединение линий раковых клеток с помощью промывок BBS.
- Использование трипсина для отсоединения клеток и нейтрализация среды с добавлением сыворотки.
- Культивирование клеток в формате 1536-луночного планшета.
- Высокопроизводительный скрининг потенциальных лекарственных кандидатов.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно культивировать 3D-сфероиды опухолей.
- Возможность высокопроизводительного анализа обеспечивает быстрый скрининг потенциальных лекарственных препаратов.
- Продемонстрирована релевантность модели 3D-культуры в процессе поиска новых лекарств.
- Потенциал для оптимизации процесса идентификации соединений-лидеров на основе хитов.
Выводы
- Данный метод культивирования 3D-сфероидов опухоли расширяет возможности поиска новых лекарственных средств.
- Он обеспечивает более точное представление биологии опухоли.
- Этот подход может привести к выявлению новых методов терапии в онкологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод сокращает трансляционный разрыв в разработке онкологических препаратов, обеспечивая возможность высокопроизводительного скрининга на физиологически релевантной 3D-модели опухолевых сфероидов. Он повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, выявляя различия в ответе на препараты в условиях 2D- и 3D-культивирования. Этот подход оптимизирует процесс идентификации соединений-лидеров (hit-to-lead) для ингибиторов пути MAPK в генетически определенных моделях рака.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в релевантной модели заболевания, которая воспроизводит трехмерные клеточные взаимодействия и пространственную организацию.
- Операционная ценность: способствует снижению механистических рисков путем сравнения эффективности соединений в 2D- и 3D-культурах для выявления контекстно-зависимой активности.
- Прогностическая ценность: облегчает идентификацию перспективных соединений-лидеров за счет обнаружения дифференциальной чувствительности моделей немелкоклеточного рака легкого с мутацией KRAS в условиях 3D.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую систему 3D-культивирования, совместимую с форматом 1536-луночных планшетов для крупномасштабного скрининга соединений.
- Практическая ценность: позволяет проводить количественный анализ люминесценции на основе уровня ATP для измерения ингибирования роста, а также построения кривых «доза-эффект» и определения значений IC50.
- Готовность анализа: использование акустического дозирования для точного внесения нанолитровых объемов соединений и герметичная инкубация для предотвращения испарения обеспечивают целостность анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Связывает этап фундаментальных открытий с доклиническими исследованиями путем моделирования взаимодействий между опухолью и стромой, а также условий, имитирующих внеклеточный матрикс, в масштабируемом формате.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет наблюдать парадоксальную активацию роста у мутантов димера RAF, что помогает в разработке стратегий комбинированной терапии и снижает риски при выборе клинических кандидатов.
- Согласованность биомаркеров: Обеспечивает возможность оценки специфических ингибиторов путей (например, MAPK) на генетически определенных фонах для установления корреляции между генотипом и ответом на препарат.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, что позволяет на ранних этапах оценить эффективность соединений в более физиологически релевантном контексте перед началом доклинических исследований.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез, демонстрируя, как 3D-культивирование изменяет чувствительность к препаратам в моделях с онкогенными драйверами, таких как НМРЛ с мутацией KRAS.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа за счет стандартизированного формирования сфероидов в 1536-луночных планшетах с соблюдением контролируемых протоколов инкубации и герметизации.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение зависимой переменной путем нормализации люминесценции АТФ по контролям с DMSO, что упрощает расчет IC50 и сравнительный анализ эффективности.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом за счет моделирования пространственной архитектуры опухоли и клональных взаимодействий, которые отсутствуют в 2D-системах.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для скрининга различных линий раковых клеток и библиотек соединений, нацеленных на консервативные пути, такие как MAPK.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности путем прямого сравнения ответов на препараты в 2D- и 3D-моделях.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость благодаря использованию совместимых с роботами рабочих процессов с 1536-луночными планшетами и герметичной инкубацией.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет выявления соединений с контекстно-зависимой активностью, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию перспективных соединений с учетом рисков, основываясь на разной эффективности в физиологически релевантных моделях.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с методами 3D-культивирования клеток, включая нейтрализацию трипсина, подсчет клеток и стерильный посев.
- Работа зависит от наличия такого оборудования, как кассетные системы на базе перистальтических насосов, акустические диспенсеры, ротационные инкубаторы и планшетные люминометры.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов герметизации, параметров инкубации (37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% влажности) и процедур нормализации данных.
- Требуется учет особенностей адаптации различных линий раковых клеток, так как эффективность формирования сфероидов может варьироваться, даже если они успешно формировались в стандартных линиях.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость предотвращения испарения при длительной инкубации и оптимизация дозирования соединений в нанолитровых объемах.
