CARIP-Seq и чип Seq: методы для идентификации связанных Chromatin РНК и ДНК белковых взаимодействий в эмбриональных стволовых клеток

Общая цель CARIP-Seq заключается в исследовании полногеномных хроматин-ассоциированных РНК. Целью ChIP-Seq является оценка белково-ДНК-взаимодействий в глобальном масштабе в эмбриональных стволовых клетках. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики и стволовых клеток, определить местоположение генома, факторы транскрипции или заполнение эпигенетического регулятора, модификацию гистонов или хроматин-ассоциированные РНК в эмбриональных стволовых клетках.

Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют проводить полногеномный несмещенный опрос РНК, связанных с компонентами хроматина, и глобальную идентификацию взаимодействий белковой ДНК. Хотя эти методы могут дать представление о биологии эмбриональных стволовых клеток, они также могут быть применены к другим типам клеток млекопитающих для изучения биологии рака или других заболеваний человека. Чтобы собрать эмбриональные стволовые клетки, сначала промойте клетки фосфатно-соевым буфером.

Затем отделите клетки с 0,25% трипсином, предварительно подогретым до 37 градусов Цельсия. После трипсинизации ресуспендировать клетки в предварительно подогретой среде MEF, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Затем добавьте 37% формальдегида в клетки в конической пробирке до конечной концентрации 1% и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут, чтобы сшить клетки.

Чтобы остановить реакцию фиксации, добавьте 1,25 молярного глицина, предварительно охлажденного при четырех градусах Цельсия, до конечной концентрации 0,125 моляра. Затем поместите трубку на вращатель и переверните ее со скоростью восемь оборотов в минуту в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут центрифугируйте образец при плотности 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

После окончания центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте гранулу предварительно охлажденным фосфатным буферным раствором и снова центрифугируйте образец. Затем удалите фосфатно-солевой буфер и заморозьте клетки в жидком азоте на минуту.

После того, как эмбриональные стволовые клетки разморозятся на льду, повторно суспендируйте гранулу в 2,5 миллилитрах буфера для ультразвука. Чтобы изучить факторы транскрипции или эпигенетические факторы, ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере для ультразвуковой обработки без додецилсульфата натрия. Для модификаций гистонов ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере, содержащем додецилсульфат натрия.

Затем для иммунопреципитации хроматина ультразвуком обрабатывайте его в течение 14–18 циклов с амплитудой 40% в режиме 30 секунд и 30 секунд в состоянии покоя. Чтобы солюбилизировать хроматин для белкового фактора ChIP, добавьте в ультразвуковой буфер 28 микролитров 10% додецилсульфата натрия. Для белковых факторов в модификациях гистонов добавьте 28 микролитров дезоксихолата натрия и 0,28 миллилитров 10% Triton X-100 и хорошо перемешайте.

Затем центрифугируйте образец при 10 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы предварительно очистить хроматин. В пробирку с низким связыванием объемом 1,5 миллилитра добавьте 40 микролитров магнитных шариков A или G. Затем промойте шарики 600 микролитрами фосфатного буферного раствора и перенесите пробирку с шариками на решетку, содержащую магнит, и инкубируйте в течение минуты при комнатной температуре.

Затем удалите фосфатно-солевой буфер и снова суспендируйте гранулы в 100 микролитрах фосфатно-солевого буфера. Добавьте в пробирку от двух до четырех микрограммов антитела и инкубируйте его, поместив на вращатель на 40 минут со скоростью восемь оборотов в минуту, чтобы способствовать связыванию антител с шариками. Затем добавьте 200 микролитров фосфатно-солевого буфера, чтобы промыть бусины.

После промывки инкубируйте экстракт хроматина, обработанный ультразвуком, на ротаторе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи для иммунопреципитации белков, связанных с хроматином. На следующий день промойте шарики и инкубируйте с буфером RIPA, буфером RIPA с солью, буфером из хлорида лития, буфером Tris-EDTA с Triton X-100 и буфером Tris-EDTA, каждый в течение 10 минут на ротаторе. Для декросслинга для ChIP, повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах буфера Tris-EDTA.

Затем добавьте три микролитра 10% додецилсульфата натрия и пять микролитров 20 мг на миллилитр протеиназы К и инкубируйте шарики при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи. После инкубации, на следующий день, несколько раз переверните трубки, оставьте их на магнитной решетке, а надосадочную жидкость переложите в свежую трубку. Затем промойте магнитные шарики, добавив 100 микролитров буфера Tris-EDTA, содержащего 0,5 молярного хлорида натрия, и соедините две надосадочные жидкости.

Для декроссинга для CARIP суспендируйте гранулы в 100 микролитрах буфера Tris-EDTA. Затем добавьте три микролитра 10% додецилсульфата натрия и пять микролитров 20 мг на миллилитр протеиназы К и инкубируйте шарики при температуре 65 градусов Цельсия в течение четырех-12 часов. Снова переверните трубку несколько раз и поместите на магнитную решетку, чтобы перенести надосадочную жидкость в свежую трубку.

Затем промойте магнитные шарики, добавив 100 микролитров буфера Tris-EDTA, содержащего 0,5 молярного хлорида натрия, а затем объедините два надосадочных вещества. Наконец, выделите образец РНК с помощью фенола, хлороформа, изоамилового спирта в соотношении от 25 до 24 к одному объему по объему. Затем используйте ДНКазу для удаления ДНК из образца иммунопреципитированной РНК, ассоциированного с хроматином.

Затем добавьте 10X DNase буфер в образец CARIP и отрегулируйте окончательный объем до концентрации 1X. Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Далее синтезируйте первую цепь комплементарной ДНК, настроив реакцию ПЦР путем добавления 10,5 микролитров РНК и одного микролитра трех микрограммов на миллилитр случайных гексамерных праймеров.

Чтобы денатурировать вторичную структуру, сначала инкубируйте трубку при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем на льду в течение двух минут. Затем добавьте исходную смесь в пробирку для ПЦР и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух минут. Затем добавьте один микролитр из 200 единиц на микролитр верхнего индекса два и запустите программу термоамплификатора.

Чтобы синтезировать вторую цепь комплементарной ДНК, запустите реакцию на льду, добавив реагенты, буфер и ферменты. Затем вортексом аккуратно перемешать реагенты и инкубировать при температуре 16 градусов Цельсия в течение двух часов. После того, как ДНК будет синтезирована, очистите комплементарную ДНК с помощью набора для очистки ПЦР.

Затем дефрагментируйте двухцепочечную ДНК, используйте сонификатор на водяной бане и 1,5-миллилитровую трубку, чтобы разделить ДНК до размера от 250 до 500 пар оснований в течение трех раз по 10 минут или четырех раз по 10 минут. Затем подготовьте библиотеку и выполните секвенирование следующего поколения. Здесь были получены фазово-контрастные изображения эмбриональных стволовых клеток для визуализации колоний стволовых клеток.

В этом протоколе клетки культивировали в присутствии или отсутствии митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мышей с LIF и/или GSK3i в питательных средах для предотвращения дифференцировки клеток. Затем, чтобы визуализировать эффективность ультразвуковой обработки хроматина сшитых эмбриональных стволовых клеток, двухцепочечную ДНК с ультразвуком загружали в 2%-ный агарозный гель. Изображение геля показывает сдвиговый хроматин в диапазоне от 200 до 500 пар оснований.

Затем были созданы библиотеки ChIP-Seq, которые были секвенированы с использованием платформы секвенирования нового поколения для оценки полногеномной занятости гистон-модифицирующего фермента и модификаций гистонов в эмбриональных стволовых клетках. Из пользовательского браузера UCSC обогащенное триметилирование H3K4, диметилирование H3K4 и KDM5B видны в ядре гена регулятора плюрипотентности, POU5F1 и в кластере HOXC. Также был проведен анализ CARIP-Seq для оценки хроматин-ассоциированных РНК в эмбриональных стволовых клетках.

Пользовательский браузерный просмотр UCSC показывает занятость РНК, ассоциированной с триметилированием H4K20, и занятость триметилирования H4K20 в эмбриональных стволовых клетках. Из результатов CARIP-Seq можно интерпретировать, что, хотя РНК связана с триметилированием H4K20, она может не взаимодействовать с конкретным локусом. После освоения этой техники ее можно сделать за четыре дня, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как исследовать хроматин-ассоциированные РНК с помощью CARIP-Seq и выявлять взаимодействия белковой ДНК в глобальном масштабе в эмбриональных стволовых клетках.