Аблация нейрональных населения с помощью двух Фотон лазера и его оценки с использованием изображений кальция и поведенческих запись в Zebrafish личинки

Общая цель этого эксперимента — проверить влияние лазерной абляции определенных нейронов на активность и поведение цепей. С помощью этой экспериментальной методики мы можем исследовать необходимость нейронов в цепи, лежащей в основе поведения. Этот метод может помочь ответить на наши ключевые вопросы в области поведения и нейробиологии, такие как как восприятие добычи и как поведение захвата добычи генерируется нейронной активностью.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что нейроны могут быть специфически абляированы из-за генетической маркировки этих нейронов, а также высокого пространственного разрешения лазера. После поднятия личинок и установки их в агарозу с низким уровнем плавления 2% в соответствии с текстовым протоколом, поместите внедренные в агарозу личинки под двухфотонный лазерный сканирующий микроскоп и запустите систему микроскопии. Откройте программное обеспечение для получения изображений и на вкладке «Лазер» нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить лазер.

Подождите, пока состояние лазера изменится с занятого на режим блокировки. На вкладке каналов установите длину волны лазера на 880 нанометров для абляции EGFP или 800 нанометров для абляции GCaMP. Выберите 20-кратный субъективный объектив, вручную перемещая объектив револьвера.

Затем перейдите на вкладку «Найти», нажмите GFP, чтобы изменить оптические пути и напрямую просмотреть флуоресценцию на глаз. Центрируйте мозг личинки рыбки данио в поле зрения, затем перейдите на вкладку «Захват», чтобы вернуться к двухфотонной микроскопии и установить мощность и усиление лазера. В качестве записи условия до абляции нажмите Z stack, чтобы выбрать опцию Z stack.

Затем, сосредоточившись на вентральном конце мозга личинки, нажмите кнопку «Установить первый», чтобы установить нижний предел, и, сосредоточившись на самой дорсальной поверхности мозга, нажмите кнопку «Установить последнюю», чтобы установить верхний предел. Наконец, нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы запустить получение изображения стека Z. Далее выберите объектив 63X субъективный, вручную перемещая объектив револьвера.

Затем нажмите на вкладку «Найти», чтобы переключиться на эпифлуоресцентную микроскопию. Центрируйте клетки, которые должны быть удалены на глаз, затем нажмите на вкладку «Снятие данных», чтобы вернуться к лазерной сканирующей микроскопии. На вкладке режима сбора данных установите размер кадра 256 на 256.

Нажмите в реальном времени и наблюдайте за интересующими вас нейронами. Затем, начиная с самой дорсальной стороны, найти фокальную плоскость, в которой находятся в фокусе клетки, подлежащие абляции. С помощью функции регионов отметьте небольшую круглую область диаметром около 1/3 размера клетки на каждом нейроне в качестве ROI.

Установите скорость сканирования на 13,9 секунды на 256 на 256 пикселей, что соответствует времени задержки лазера примерно 200 микросекунд на пиксель или 200 микросекунд на полмикрона. Кроме того, установите цикл итераций на четыре повторения. Нажмите кнопку Начать эксперимент, чтобы выполнить временные ряды и функции отбеливания.

Сравните изображение до абляции с изображением после абляции в цикле временных рядов, чтобы убедиться, что флуоресценция в клетках-мишенях исчезла. Далее сдвиньте фокальную плоскость немного вглубь и выберите следующую фокальную плоскость, где появляются неабляционные клетки. Выполните функцию обесцвечивания, как только что продемонстрировано, и повторяйте процесс до тех пор, пока все клетки в интересующей нервной структуре не будут удалены.

После абляции проверьте клетки на наличие отмененной флуоресценции и при необходимости повторите лазерное облучение. После облучения личинки должны быть восстановлены. Аккуратно сделайте крошечные перпендикулярные надрезы в агарозе вокруг личинок.

Затем подождите, пока рыба выплывет из агарозы самостоятельно, когда действие анестетика закончится. После культивирования парамеции и обезболивания личинки рыбы данио в соответствии с текстовым протоколом поместите личинок в агарозу с низкой температурой плавления 2% и немедленно удалите излишки агарозы так, чтобы поверхность агарозы выглядела слегка выпуклой. С помощью рассекающей иглы быстро сориентируют личинок в вертикальном положении.

Затем с помощью хирургического ножа сделайте несколько небольших надрезов в агарозе, чтобы удалить агарозу вокруг головы рыбы зебры, что освобождает место для плавания парамеция. Аккуратно удалите остатки агарозы, аккуратно вылив воду системы на камеру. Затем поместите один парамеций в записывающую камеру, чтобы он служил визуальным стимулом.

Затем поместите записывающую камеру под эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный научной CMOS-камерой, и выберите объектив с 2,5-кратным увеличением. Запустите приложение для получения изображений для установленной камеры. Нажмите на панель последовательности и выберите запись на жестком диске на панели.

В разделе настроек сканирования установите количество кадров на 900 или любое другое общее количество кадров. На панели захвата установите время экспозиции на 30 миллисекунд и группирование на два на два. Нажмите кнопку реального времени на панели захвата, чтобы найти личинок в поле зрения камеры и сфокусироваться, а затем нажмите кнопку «Остановить прямой эфир» и нажмите кнопку «Запустить».

Сохраните фильм в формате cxd и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. После настройки системы поведенческой записи и помещения личинки в записывающую камеру согласно текстовому протоколу с помощью микропипетки соберите 50 параметриев и поместите их в записывающую камеру. Чтобы разместить защитную крышку на верхней части записывающей камеры, нанесите небольшую каплю воды на защитную крышку перед тем, как положить ее на водную поверхность записывающей камеры, чтобы избежать попадания воздуха в камеру.

Поместите камеру записи в систему освещения. Затем запустите покадровую съемку со скоростью 10 кадров в секунду в течение 11 минут. Наконец, анализ по текстовому протоколу.

В этом эксперименте с линией Gal4, которая маркирует ядра в претектальной области и субпопуляцию нейронов обонятельной луковицы. Претектальные нейроны были удалены лазером с обеих сторон. Обонятельные нейроны были удалены в качестве контроля.

Результаты показывают, что двухфотонный лазер может аблять клетки-мишени, оставляя соседние нейриты нетронутыми. В этом эксперименте была исследована функциональная связность претектальных нейронов, которые проецируют свои аксоны к ипсилатерально ILH. Как претектум, так и ILH показали активность нейронов в непосредственном присутствии добычи, что позволяет предположить, что активность обоих нейронов обусловлена визуально.

Визуализация кальция также использовалась для наблюдения за активностью нейронов в претектуме и ILH в личинках претектальных нейронов. Левый претектум, который был удален лазером, показал остаточную или отсутствующую нейронную активность. Кроме того, ипсилатеральная ILH продемонстрировала резко смещенную нейрональную активность, что позволяет предположить, что основной вход в ILH поступает из ипсилатерального претектума.

Напротив, ILH на другой стороне лазерно абляционного претектума показала нейронную активность, сравнимую с нейронной активностью в ипсилатеральном претектуме, что позволяет предположить, что правая ILH получает входные сигналы от правой претектума. После освоения лазерная абляция может быть проведена примерно за один час для каждой личинки рыбы зебры. При проведении этой процедуры важно помнить, что при правильном лазерном облучении следует аблять только целевые нейроны, избегая теплового повреждения лазером.

После этой процедуры может быть выполнена абляция нейронов в других областях мозга, таких как передний или задний мозг, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как эти нейроны участвуют в когнитивных или двигательных функциях. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области поведенческой нейробиологии к изучению функциональных нейронных цепей в моделях рыб данио. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конкретно удалять лазером нейроны в мозге личинок рыбок данио-рерио и оценить функциональные и поведенческие последствия.

Не забывайте, что работа с лазером может быть крайне опасной, и всегда соблюдайте инструкции производителя при подготовке этой процедуры.