Поколение сфероидов человеческого носа эпителиальных клеток для исследования регулятор трансмембранной проводимости индивидуализированные муковисцидоза

Общая суть этой процедуры заключается в получении сфероидов из носовых клеток человека, которые в конечном итоге могут быть использованы в качестве анализа для функциональных исследований CFTR. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области муковисцидоза, такие как оценка реакции отдельного субъекта на препараты, изменяющие CFTR, в модельной системе ex vivo. Основное преимущество этого метода заключается в том, что большое количество сфероидов генерируется в относительно короткие сроки из небольшого образца назальной клетки, что позволяет проводить обширное тестирование.

Демонстрировать процедуру будут Лорен Стрекер и Джессика Мончивайз, техники из моей лаборатории. После обработки и расширения клеток назального эпителия человека или HNE на фидерных фибробластах в соответствии с текстовым протоколом доведите предварительно приготовленную среду для расширения, среду для дифференцировки, 0,1% раствор трипсина ЭДТА и стерильный PBS до комнатной температуры в течение 30 минут. Затем используйте 70% этанол для очистки контейнеров и переложите их в чистый шкаф биобезопасности.

В шкафу биобезопасности используйте пипетку Пастера, подключенную к вакуумной линии, для отсасывания и удаления среды из культуры HNE. Затем с помощью чистой серологической пипетки используйте пять миллилитров PBS для мытья посуды, добавляя, перемешивая и отсасывая буфер. Добавьте в культуру пять миллилитров 0,1%-ного раствора трипсина ЭДТА и верните ее в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на пять минут.

Затем под инвертированным микроскопом с температурой от 4 до 10 раз проверьте, что клетки отделяются от чашки, становятся круглыми и плавают. Осторожно постучите по боковой стороне чашки для культивирования, чтобы вытеснить клетки, и, при необходимости, повторно инкубируйте чашку еще на пять минут, пока большинство клеток не отделятся. Далее с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров добавьте в чашку пять миллилитров расширительной среды и соберите всю жидкость в маркированную стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров

Если клетки остаются прилипшими к чашке для культивирования после трех раундов трипсинизации, используйте стерильный скребок для клеток, чтобы аккуратно освободить оставшиеся клетки, и с помощью пяти миллилитров расширяющей среды вымойте скребок и чашку и соберите содержимое в ту же меченую коническую пробирку. Центрифугируйте пробирку при 360-кратном g в четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Отсадите надосадочную жидкость и используйте один миллилитр расширяющей среды для ресуспендирования клеточной гранулы.

Затем с помощью гемоцитометра подсчитайте клетки. Разморозьте матрицу базальной мембраны на льду в соответствии с инструкциями производителя. Отделите соответствующее количество дифференциально трипсинизированных пассажных клеток для получения конечной концентрации 500 000 клеток на миллилитр матрицы.

Для четырехлуночного планшета используйте 200 000 клеток и соберите их в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Далее центрифугируйте клеточную смесь при плотности не более 360 раз г в течение пяти минут. Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр полностью и тщательно отсадите и выбросьте среду, стараясь не потревожить клеточную гранулу.

Держите трубку с клетками на льду, когда вы не работаете с ней активно. С помощью наконечника для пипетки объемом в один миллилитр добавьте в клетки 100 микролитров матрицы базальной мембраны на запланированную лунку. Не полностью опорожняя наконечник пипетки, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы осторожно и тщательно ресуспендировать клетки.

Двигайтесь быстро, чтобы избежать застывания матрицы. Чтобы засеять 100 миллилитровую матрицу аликвот в каждую лунку четырехлуночного планшета для ЭКО, используйте чистые ножницы, чтобы обрезать дистальные три-четыре миллиметра от 200-микролитрового наконечника пипетки. Осторожно и медленно нанесите пипеткой каплю 100 микролитров смеси клеточного матрикса в центр каждой лунки, следя за тем, чтобы капля оставалась сферической и не касалась стенок лунки.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут до полного затвердевания. Затем осторожно нанесите пипеткой по 500 микролитров дифференцировочной среды в каждую лунку, стараясь не нарушить падение матрицы. Следите за тем, чтобы средство просто покрывало каплю, и при необходимости добавьте еще.

Для культивирования сфероидов HNE с помощью кончика пипетки объемом в один миллилитр осторожно отсасывают всю среду из лунки, избегая при этом матрицы, которая приведет к разрушению сфероидов. Затем с помощью свежего наконечника для пипетки объемом в один миллилитр, избегая прикосновения к матрице или ее нарушения, аккуратно добавьте 500 микролитров дифференцировочной среды в лунку вокруг матрицы. Продолжайте инкубацию сфероидов, заменяя среду для дифференцировки три раза в неделю, как показано выше.

Под инвертированным микроскопом при 20-кратном увеличении ежедневно оценивайте морфологию сфероида. Сфероиды должны сформироваться в течение трех-пяти дней после нанесения покрытий и достичь зрелости примерно через 10 дней. HNE должны прикрепиться к чашке для культивирования и образовать небольшие островки в течение 72 часов после посева.

Примеры хорошего и плохого формирования островов за одну неделю показаны здесь. Островки должны расширяться, чтобы покрыть блюдо в течение 15-30 дней. В течение первых трех-четырех дней культивирования в матриксе должны начать формироваться небольшие кистозные структуры, которые созревают в течение примерно 10 дней.

При нанесении покрытия с описанной плотностью, успешные культуры будут содержать от 50 до 100 сфероидов на каплю матрицы. Просветы могут быть относительно чистыми, как у CFTR дикого типа, или заполнены клеточным мусором и слизью, как у сфероидов CF. Маскировка для очерчивания просветной области сфероидов продемонстрирована на этих двух панелях.

Здесь приведены примеры плохо сформированных неудачных сфероидальных культур. Как показано на этих графиках из функциональных анализов, сфероиды у пациентов с CFTR дикого типа должны набухать в течение часа при стимуляции и должны уменьшаться или уменьшаться при стимуляции в присутствии ингибитора CFTR inh-172. Сфероиды из субъекта, гомозиготного по F508del-CFTR, должны либо уменьшаться, либо незначительно набухать с увеличением набухания или меньшим уменьшением усадки при фармакологической коррекции модуляторами CFTR VX809 и VX770.

После освоения посев сфероидов назальных клеток может быть выполнен за 15-20 минут, если он выполнен правильно. При выполнении этой процедуры важно помнить о соблюдении чистоты в шкафу биобезопасности, чтобы свести к минимуму риск загрязнения проб и избежать любых рисков для вашего собственного здоровья. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фиксация, окрашивание и микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы о морфологии и составе клеток.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как получить первичные сфероиды из носовых клеток человека, которые можно использовать в качестве персонализированного анализа функции CFTR. Не забывайте, что работа с первичными тканями человека может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правильное использование средств индивидуальной защиты.