Экдистероидов рецепторов на основе единственного гена переключатель за преднамеренное выражение трансген с надежностью, обратимость и незначительной утечки

Общая цель этого эксперимента заключается в модуляции экспрессии трансгена путем введения химического индуктора тебуфенозида. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной и молекулярной биологии, например, когда необходимо стимулировать экспрессию интересующего гена в желаемое время с желаемой силой. Основное преимущество этого метода заключается в том, что путем объединения всех необходимых для экспрессии трансгена элементов в одном векторе, экспрессию трансгена можно стимулировать путем введения химического индуктора тебуфенозида.

После субклонирования EGFP или ANKRD13A трансгенов в соответствии с текстовым протоколом приготовьте четыре чашки для клеточных культур, содержащие свежепассаженные клетки HEK 293 в пяти миллилитрах DMEM с добавлением от 5 до 10% FBS и антибиотиков, которые в дальнейшем будут называться питательной средой. Поддерживайте в клетках температуру 37 градусов по Цельсию. Когда плотность клеток достигнет от 50 до 60%, добавьте три микролитра реагента для трансфекции к 200 микролитрам разбавителя, содержащего ДНК.

После инкубации реакции при комнатной температуре в течение 30 минут добавьте смесь в ячейки HEK 293. Используйте две тарелки для трансфекции, а две другие оставьте без обработки в качестве контроля. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-24 часов.

После инкубации добавьте Teb в один из трансфицированных образцов и в один из нетрансфицированных контрольных образцов. Оставьте два других образца без обработки в качестве экспериментального контроля. Инкубируйте планшеты от 12 до 48 часов.

При использовании вставки EGFP анализируйте экспрессию EGFP под флуоресцентным микроскопом. В противном случае, чтобы собрать клетки для иммуноблоттинга, используйте ледяной PBS для двукратного промывания клеток. Затем с помощью скребка для клеток удалите их из пластины и переложите в 15-миллилитровую коническую трубку.

Затем вращайте трубки при температуре 21 000 раз g и от 18 до 25 градусов Цельсия в течение двух минут. Затем, после отказа от PBS, добавьте в гранулу 0,5 миллилитра ледяного реагента для экстракции белка млекопитающих, или M-PER, и ингибитор протеазы. Ресуспендирование клеток с помощью нескольких раундов пипетирования.

Затем инкубируйте клеточную суспензию при температуре от 18 до 25 градусов Цельсия и комнатной температуре в течение 15 минут. Вращайте лизат клеток при температуре 21 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем переложите водную надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, и проанализируйте ее с помощью иммуноблоттинга соответствующими антителами.

Чтобы погасить раздражители Teb, удалите содержащую Teb питательную среду из клеток и дважды промывайте клетки с помощью предварительно нагретого PBS. Затем добавьте один миллилитр 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. Добавьте к клеткам 10 миллилитров предварительно подогретой питательной среды, не содержащей Teb, и используйте скребок для их сбора.

Перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку. Затем вращайте ячейки при температуре 21 000 g и температуре от 18 до 25 градусов Цельсия в течение двух минут. Ресуспендируйте клетки в 50 миллилитров предварительно подогретой питательной среды, не содержащей Teb, и перенесите пять миллилитров клеток в три 60-миллиметровые чашки для свежих клеточных культур.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24, 48 и 72 часов соответственно. Наконец, соберите клетки в разные моменты времени и измерьте уровни экспрессии трансгена с помощью иммуноблоттинга. В этом эксперименте, в котором оценивали активность и негерметичность pEUI-plus-EGFP, трансфектанты фиктивных векторов не показали флуоресцентного сигнала независимо от обработки Teb.

Тем не менее, трансфектанты pEUI-plus-EGFP стали постепенно сенсибилизироваться к возрастающему количеству Teb. Что еще более важно, трансфектанты pEUI-plus-EGFP, не обработанные Teb, не вызывали никаких обнаруживаемых сигналов EGFP. ANKRD13A с тегом FLAG был использован для дальнейшей проверки скорости отклика pEUI-plus на Teb.

Как показано в этом вестерн-блоттинге с использованием антител против FLAG, трансфицированные клетки HEK 293 продемонстрировали сильную экспрессию ANKRD13A после 24-часового лечения Teb. Кроме того, истощение Teb продемонстрировало обратимость переключения гена pEUI-plus, поскольку ANKRD13A больше не обнаруживается в клетках, культивируемых без Teb. После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что почти весь эксперимент должен проводиться в условиях, свободных от микробов. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как система Tet-On или Tet-Off, для дифференциальной экспрессии двух различных трансгенов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению молекулярной физиологии на клеточном уровне.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать вектор переключения гена pEUI-plus с целью индуцирования экспрессии трансгена в желаемое время с желаемой силой. Не забывайте, что работа с тебуфенозидом может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата.