Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Общая цель этого протокола микроинъекции заключается в модификации генома западного кукурузного корневого червя. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии западного кукурузного корневого червя и его способности быстро преодолевать методы борьбы с вредителями, такие как BT Toxin и RANI. Помимо западных кукурузных корневых червей, этот метод также может быть применен к аналогичным видам, таким как южные и северные корневые черви.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда меня попросили помочь с инъекциями RANI в западном кукурузном корневом черве еще в 90-х годах. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности. Потому что выращивание западных кукурузных корневых червей в лаборатории трудоемко.

И показатели выживаемости остаются низкими при использовании современных технологий. Получите от 500 до 1000 взрослых особей недиапаузирующих корневых червей в надежной компании или исследовательской лаборатории. И размещают их в клетках объемом 30 кубических сантиметров.

Храните стандартную искусственную диету от корневого червя в контейнерах для хранения продуктов глубиной около одного сантиметра. Неиспользованная диета может храниться при температуре четыре градуса Цельсия до двух месяцев. Чтобы накормить корневого червя, загрузите в 100-сантиметровые чашки Петри от 10 до 15 грамм рациона.

Загрузите по одной миске с едой в каждую клетку с корневыми червями. И пополнять его, когда запас заканчивается или рацион иссякает. Также держите в каждой клетке резервуар для воды объемом 300 миллилитров, накрытый ватным тампоном, который будет служить источником воды.

Меняйте воду, когда она заканчивается. Поддерживайте содержание корневого червя в клетке при температуре 26 градусов Цельсия при влажности 60% и световом цикле 14/10 в инкубаторе для выращивания насекомых. Выключайте свет позже в тот же день, например, в полночь, чтобы яйца были отложены до утренних рабочих часов.

Сначала соберите эмбрионы. Для поверхности для сбора яиц загрузите 100-миллиметровую чашку Петри 30 миллилитров 1%-ного агара и воды. Затем положите на агар один слой фильтровальной бумаги, а затем четыре слоя марли

Каждый слой следует обрезать по размеру. Далее, как можно ближе к вечеру, поместите тарелку для сбора яиц в клетку с корневым червем и накройте ее тентом из фольги. Затем на следующее утро снимите камеру для сбора яиц.

С помощью щипцов возьмите по одному слою марлевой салфетки за раз и поместите в стакан объемом 500 миллилитров, наполненный водой. Смойте яйца с марлевой ткани, покрутив в воде. Затем с помощью пипетки с помощью луковицы переложите яйца в другую мензурку с водой в качестве этапа промывки.

Выполните таким образом два или три мытья. Затем положите очищенные яйца на фильтровальную бумагу с минимальным количеством воды. Затем подготовьте слайд, приклеив к нему лист черной фильтровальной бумаги для улучшения контраста.

Затем сбрызните тонкие линии нетоксичным клеем на бумагу, которая будет использоваться для фиксации яиц. Держите клей ниже обхвата яйца. Пока клей влажный, с помощью тонкой кисти поместите яйца на клеевую линию.

Соблюдайте расстояние между каждым яйцом как минимум в одно яйцо. Подготовьте несколько рядов яиц на горке. Теперь яйца должны быть введены в течение 30 минут.

Теперь объедините вспомогательную плазмиду, донорскую плазмиду и феноловый красный буфер. Используйте высококачественные спиральные плазмиды, изготовленные из коммерческого набора, не содержащего эндотоксинов. Фортекс коротко перемешать.

А затем раскручивайте частицы в течение трех минут на максимальной скорости. Далее засыпку вытягивают иголки боросиликатного стекла с 0,5 до 1 микролитра раствора для инъекций. Если образуются пузырьки, обязательно удалите их.

Затем прикрепите иглу для инъекций к микроманипулятору. Теперь при необходимости под микроскопом аккуратно отломите запаянный кончик иглы с помощью тонкой пары щипцов или аккуратно прикоснувшись кончиком к стеклянной преграде. Постарайтесь сделать как можно меньшее отверстие, которое выпустит инъекционный раствор.

Перед введением яиц корневого червя с помощью тонкой кисти тщательно смочите поверхность одного-трех подготовленных яиц стерильной водой. Затем введите смоченные эмбрионы. Аккуратно введите иглу в середину эмбриона, и введите небольшой объем раствора.

Начните с использования давления от 10 до 13 фунтов на квадратный дюйм и регулируйте давление по мере необходимости. Сухие зародыши имеют ярко выраженную круглую форму, при предварительном смачивании каждого зародыша водой изменится их форма и размягчится скорлупа яйца, что позволит игле легко проникнуть. Успешно введенный эмбрион будет иметь небольшое количество красного цвета.

Если яйцо было повреждено, выглядит странно или не может быть введено, то раздавите его или снимите с предметного стекла. После того, как все яйца будут введены, переместите фильтровальную бумагу с находящимися на ней яйцами в чашку с 1%-ным агаром. Затем запечатайте блюдо парафиновой пленкой и инкубируйте его при температуре 26 градусов Цельсия до тех пор, пока не вылупятся личинки.

Через 12 дней после инъекции начните проверять наличие личинок каждый день в течение следующих двух недель. Перенесите личинок с помощью тонкой щетки в ящик для выращивания с пророщенной кукурузой и почвой, чтобы вырастить их в стандартных условиях. Трансформация зародышевой линии корневого червя была предпринята путем одновременной инъекции транспозазы, несущей плазмиду, с транспозоном, несущим плазмиду, в преклеточные эмбрионы.

У 26 выживших каждая экспрессия EFP использовалась для скрининга на вставку, связанную с донорским элементом. Несмотря на то, что грудное потомство было идентифицировано, скрининг эмбрионов корневых червей с помощью интенсивного источника света оказался смертельным. В следующем раунде трансформации зародышевой линии использовался ген красного флуоресцентного белка, управляемый конститутивно активным промотором из Drosophila melanogaster.

Показатели выживаемости улучшились, но была зарегистрирована только одна красная положительная личинка DS. Затем эмбрионы вводили микроинъекции с помощью только буфера или с помощью хелперов и тщательно маркированных плазмид донорской ДНК. Аналогичное соотношение эмбрионов вылупилось при введении только плазмид или буфера.

И что интересно, только около половины неинъекционных эмбрионов вылупились. Таким образом, смертность от манипуляций с эмбрионами для инъекции была столь же высокой, как и от выполнения инъекции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать микроинъекции эмбрионов Western Corn Rootwall.

После освоения двухсот или трехсот эмбрионов можно вводить в час с помощью этой техники. Этот метод обязан методикам, разработанным для трансформации зародышевой линии Drosophila melanogaster, которые служат шаблонами, применимыми ко многим другим видам. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как редактирование генома на основе CRISPR/Cas9, для создания целевых мутаций в геноме Western Corn Rootwall.

Для того, чтобы ответить на конкретные вопросы о функции генома.