Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Общая цель этого случайного мутагенеза состоит в том, чтобы выявить мутации, которые дестабилизируют гетерохроматин. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гетерохроматина, такие как факторы, регулирующие образование и поддержание гетерохроматина. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может целенаправленно нацеливаться на желаемый ген для мутагенеза, даже если этот ген является необходимым.

Для начала приготовьте дрожжевой экстракт с добавками, или YES, без аденина, среду глутамата Помбе или PMG и PMG без аденина, смешав компоненты, как показано в этой таблице. После автоклавирования и добавления G418 при необходимости перемешайте среду еще пять-десять минут. Затем разлейте скот в 90-миллилитровые чашки Петри и храните тарелки при температуре четыре градуса Цельсия.

Используя клонированный rpt4 положительный, с его пятью простыми и тремя простыми UTR и тихой мутацией, а также праймеры p5 и p6 и специальную полимеразу, предназначенную для генерации высокого процента ошибок, проводят подверженную ошибкам ПЦР общим объемом 50 микролитров. После генерации конструкта преобразования-слияния, согласно текстовому протоколу, инокулировать десять миллилитров среды YES дрожжами, и инкубировать ее более 16 часов до насыщения. Используйте 200 миллилитров среды YES для разбавления клеток до OD600 0,2 и инкубируйте культуру при 30 градусах Цельсия с встряхиванием в течение пяти-шести часов до OD600 от 0,6 до 0,8.

Рассчитайте объем ячеек, которые в сумме дают OD600 из 30. Затем распределите клетки в четыре 50-миллилитровые конические пробирки и охладите их на льду в течение 10 минут. Соберите клетки путем центрифугирования при температуре 1050 G и четырех градусах Цельсия в течение трех минут.

Затем поместите микрофуге с кассетной ДНК и 10 электрокюветами на лед. Все еще находясь на льду, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 15 миллилитров 1,2-молярного сорбита, осторожно встряхните пробирки, чтобы повторно суспендировать клетки, затем центрифугируйте клетки при 1050 G и четырех градусах Цельсия в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и проведите повторное промывание сорбитом.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторно подвесьте клетки и соберите их все в одну 15-миллилитровую коническую трубку. Далее добавьте 1,2 моляра сорбита до 2,4 миллилитров.

Держите трубку с клетками на льду. Затем добавьте 200 микролитров взвешенных в сорбите элементов в пробирку, содержащую конструкцию Fusion PCR, хорошо перемешайте и перенесите образец в электрокювету. Важно не использовать избыточное количество кассеты для ПЦР, так как это даст погрешности выписки.

Электропорировать элементы можно с помощью следующих вариантов: добавить в каждую электрокювету по 600 микролитров 1,2-молярного сорбита на общий объем 800 микролитров. Затем распределите ячейки по четырем пластинам YES. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Затем выполните нанесение покрытия на YES и G418 перед инкубацией планшетов еще в течение трех дней. Для каждой пластины YES и G418 выполните нанесение реплики на пластины YES без аденина и PMG без пластин с аденином. Инкубируйте пластины-реплики при температуре 30 градусов Цельсия в течение одного-двух дней, пока некоторые из колоний на пластинах YES без адениновых пластин не приобретут белую окраску.

Сравните ДА без аденина и PMG без адениновых пластин и выберите ячейки, которые показывают розовый или белый цвет на пластине YES без аденина, а также растут на PMG без пластины с аденином. Не отбирайте колонии без роста на PMG без аденина, так как они дают ложноположительные результаты. Соберите каждую колонию и добавьте ее в 10 микролитров раствора СЗЗ, содержащего 2,5 миллиграмм на миллилитр зимолязы 100Т.

Затем инкубируйте колонии при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 30 минут. После инкубации используйте один микролитр этого раствора в качестве исходного шаблона для ПЦР колоний. После расщепления выбранных колоний и проведения гель-электрофореза в соответствии с текстовым протоколом пометить колонии, продукты ПЦР которых были разрезаны XHO1, и залатать их на планшеты YES plus G418.

После выделения гДНК из клеток делящихся дрожжей и секвенирования продуктов ПЦР по текстовому протоколу сравнивают полученную последовательность с последовательностью дикого типа для выявления мутаций. Как только мутации будут повторно введены в клетки дикого типа, используйте пятнистость для подтверждения фенотипа в новосозданных мутантных клетках. Мутанты rpt4, созданные с использованием протокола, продемонстрированного в этом видео, могут быть проанализированы путем оценки окраски колоний.

Как показано на этом рисунке, колонии были замечены на соответствующих пластинах в уменьшающемся количестве клеток. Адениновый репортер, вставленный в область гетерохроматина, подавляется в клетках дикого типа и образует красные колонии на YES без адениновых пластин. После того, как гетерохроматин дестабилизируется и репортерный аденин экспрессируется, на YES можно наблюдать белые колонии без адениновых пластин, как это наблюдается с мутантом clr4-delta.

Скрининговые мутанты rpt4 показаны на рисунке, а мутант rpt4-1 демонстрирует наиболее выраженную дестабилизацию гетерохроматина. После освоения этой техники ее можно сделать за две недели, чтобы получить желаемых мутантов. При попытке выполнить эту процедуру важно исключить ложные срабатывания, так как они происходят чаще, чем ожидалось.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как очистка белка и тесты на активность ферментов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как природа белков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить мутантов в гене-мишени с желаемым фенотипом.