Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Общая цель этой процедуры заключается в выделении внеклеточных везикул из среды культивируемой in vitro взрослой Schistosoma japonicum. Этот метод позволяет эффективно изолировать EV in vitro в культуральной среде из взрослой Schistosoma japonicum. Основным преимуществом данной методики является возможность эффективной изоляции внеклеточных везикул от кратковременной культуральной среды in vitro, что позволяет свести к минимуму стресс, потенциально приводящий к нефизиологической секреции ВВ.

Демонстрацию проведет Цзюньтао Лю, техник из моей лаборатории. Соберите паразитов в 500-миллилитровый стакан и тщательно промойте его три раза, используя 200 миллилитров теплого PBS. Промывки должны быть краткими, а для отделения паразитов используйте гравитационное осаждение.

Далее, на 90-миллиметровую посуду, выложите на тарелку около 200 пар червей на каждую тарелку. В посуде вымойте паразитов еще два раза, используя гравитационное осаждение. Для этих промываний используйте теплую среду RPMI с добавлением пера-стрептококка.

Замените вторую полоску на 40 миллилитров средства без антибиотиков. Затем культивируйте паразитов при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислым газом в течение двух часов. Через два часа переложите среду из планшетов в центрифужные пробирки, а затем соберите яйца и остатки червей в дозе 2000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем соберите надосадочную жидкость и переложите ее в свежую трубку. Далее надосадочную жидкость фильтруют через шприцевой фильтр толщиной 0,22 микрона, а отфильтрованный раствор собирают в диализный мешок с молекулярной массой 3,5 килодальтоны. Затем диализуйте раствор с помощью 8%PEG8000 раствора при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

Этот шаг важен для увеличения выхода внеклеточных везикул. На следующий день переложите диализованный раствор в новую пробирку, и добавьте 0,5 объема реагента для выделения экзосом. Смешайте раствор до однородности, и инкубируйте при температуре около пяти градусов Цельсия в течение ночи.

На следующее утро центрифугируйте смесь при 15 000 г в течение одного часа при температуре около пяти градусов Цельсия. Далее аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость, а также повторно суспендируйте гранулу EVs в двух миллилитрах PBS. Гранула вряд ли будет видна.

Для вестерн-блоттинга сначала определите концентрацию белка в образце, например, с помощью анализа BCA. Затем приготовьте от 10 до 20 микрограммов EV в 22,5 микролитрах буфера RIPA. Далее добавьте 7,5 микролитров загрузочного буфера 4X, и нагревайте смесь до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.

После термической обработки отделите белки внеклеточных везикул на 12% геле SDS-PAGE. После запуска геля белки переносятся в мембрану PVDF. Зондируйте мембрану антителами к CD63 в разведении от 1 до 1000.

Затем обработайте мембрану антикроличьим препаратом IgG-HRP в разведении от одного до 5 000. Теперь используйте реагент для детектирования ECL для создания мембраны, а затем проведите анализ на системе хемилюминесцентной визуализации. Начните с переноса пяти микрограммов образца в полипропиленовую ультрацентрифужную пробирку и отрегулируйте объем до 12 миллилитров с помощью среды RPMI-1640.

Затем центрифугируйте образец при 110 000 г в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Затем приготовьте 2X внеклеточную суспензию везикул, добавив в гранулу один миллилитр разбавителя С.

Суспендируйте гранулу с помощью щадящего пипетирования. Теперь приготовьте свежий 2Х раствор красителя. Добавьте два микролитра этанолового красителя PKH67 к одному миллилитру разбавителя C в микрофуге и хорошо перемешайте.

Затем окрасьте образец, смешав два раствора и инкубируя смесь при комнатной температуре в течение четырех минут. Далее прекратите окрашивание, добавив четыре миллилитра FBS и подождите еще минуту. Затем добавьте среду RPMI-1640, чтобы отрегулировать объем до 12 миллилитров, и раскрутите суспензию, чтобы изолировать испачканные пузырьки.

Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте гранулированные электромобили, меченные PKH67, в 12 миллилитрах среды RPMI-1640. Затем повторите центрифугирование, но на этот раз соберите пузырьки в одном миллилитре PBS.

Для анализа поглощения в течение ночи готовят культуры клеток млекопитающих в шестилуночных планшетах. На следующее утро добавьте пять микрограммов везикул, меченных PKH67, в каждую лунку и продолжайте культивирование в течение двух-четырех часов. После инкубации удалите среду, и промойте клетки PBS два раза.

Затем зафиксируйте клетки на 15 минут, дважды промойте их PBS и покрасьте DAPI перед визуализацией. Шистосомы на стадии печени были собраны у кроликов через 28 дней после заражения. Затем у червей из шистосом были собраны внеклеточные везикулы и проанализированы.

Размер их частиц, определенный с помощью анализа наночастиц Malvern, варьировался от 100 до 400 нанометров, при этом основная масса населения составляла около 220 нанометров. Просвечивающая электронная микроскопия показала, что внеклеточные везикулы имеют круглую форму и имеют диаметр от 100 до 200 нанометров. Вестерн-блоттинг-анализ показал, что изолированные внеклеточные везикулы были распознаны с использованием антител к CD63, которые являются типичным маркером внеклеточных везикул.

Флуоресцентная микроскопия меченых PKH67 внеклеточных везикул, интернализованных клетками клона NCTC 1469, показала, что внеклеточные везикулы в основном распределены в цитоплазме клеток-реципиентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить ВВ in vitro культуральную среду из взрослой Schistosoma japonicum.