Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

Общая цель этой процедуры заключается в генерировании геномных точечных мутаций у C.Elegans с использованием одноцепочечных шаблонов направленной репарации олигонуклеотидов гомологии и рибонуклеопротеинов CRISPR/Cas9. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как определение патологических последствий генетической изменчивости, связанной с нейродегенеративными заболеваниями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что геномные точечные мутации могут быть сгенерированы быстро, что позволяет проводить функциональное изучение генетической изменчивости в контексте эндогинального регуляторного контроля, избегая при этом предостережений сверхэкспрессии белков.

Чтобы выбрать мишень для sgRNA, откройте веб-страницу, показанную здесь. Введите примерно 60 пар оснований последовательности, расположенных по бокам от нужной интересующей вас правки. После выбора генома C.Elegans и соседнего мотива протоспейсера в соответствии с текстовым протоколом, нажмите кнопку «Отправить».

На странице результатов выберите первую целевую последовательность, наиболее близкую к интересующей вас правке. После получения лиофилизированную пробирку, содержащую sgРНК, центрифугируют при комнатной температуре и не менее 12 000 г в течение одной минуты. Добавьте в пробирку 60 микролитров нуклеазного TE и с помощью пипетки p200 мягко ресуспендируйте пипеткой вверх и вниз от 15 до 20 раз.

Конечная концентрация составляет 50 микромоляров. Разработка HDR-матрицы ssODN, содержащей интересующую мутацию, уникальный по рестрикции эндонуклеазный сайт, тихую мутацию одного или обоих Gs в последовательности NGG PAM и 50 пар оснований с пятью простыми и тремя простыми гомологическими плечами, фланкирующими первую и последнюю мутацию. После получения центрифугируют лиофилизированную пробирку, содержащую ssODN, как показано выше, затем используют безнуклеазный DD H20 для мягкой ресуспендирования ssODN до конечной концентрации 100 микромоляров.

Чтобы приготовить смесь для инъекций, центрифугируйте показанные здесь реагенты на максимальной скорости и при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. В указанном порядке добавьте реагенты в безнуклеазную ПЦР-пробирку. Затем с помощью пипетки p20 аккуратно и тщательно перемешайте содержимое.

Выдержите трубку при комнатной температуре в течение десяти минут. После введения P0 животным в соответствии с текстовым протоколом дайте им восстановиться при комнатной температуре в течение одного-двух часов на 35-миллиметровом планшете NGM, засеянном OP50. Затем с помощью червячной кирки из платиновой проволоки переведите одиночных введенных животных P0 на отдельные 35-миллиметровые пластины NGM OP50.

Через два дня после инъекции используйте флуоресцентный микроскоп для идентификации пластин P0, содержащих потомство F1, экспрессирующее mCherry в глотке. Выберите три пластины P0, которые содержат наибольшее количество животных с положительным результатом mCherry F1. Из каждой из трех выбранных пластин P0 используйте червячный кирку, чтобы выделить от восьми до 12 mCherry положительных F1 животных, что в общей сложности составляет от 24 до 36 mCherry положительных F1.

Дайте отдельным F1 самооплодотвориться и отложите яйца при комнатной температуре в течение одного-двух дней. После одного-двух дней откладки яиц с помощью червячной кирки перенесите F1 в отдельные колпачки ПЦР-полосок, содержащие семь микролитров буфера для лизиса червей. Центрифугируйте пробирки для ПЦР на максимальной скорости и при комнатной температуре в течение одной минуты, чтобы опустить животных на дно пробирки.

Затем заморозьте пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия на один час. Далее лизуйте замороженных червей в амплификаторе с помощью следующей программы. Затем настройте мастер-смесь для ПЦР, как показано в этой таблице.

Добавьте 21 микролитр мастер-смеси для ПЦР в чистые пробирки для ПЦР, затем добавьте четыре микролитра пробирки для лизиса червя и хорошо перемешайте пипетированием. Затем запустите программу ПЦР, следуя рекомендациям производителя. Очистите ПЦР-реакции с помощью набора для очистки и концентрата ДНК, следуя инструкциям производителя.

Затем разбавьте ДНК, добавив в спиновую колонку 10 микролитров воды. После настройки мастер-смеси фермента рестрикции добавьте по 10 микролитров в каждую очищенную реакцию ПЦР и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Затем разделите переваренные продукты ПЦР на 1,5%-ном агарозном геле с использованием буфера 1x TAE при напряжении 120 вольт.

Исследуйте образцы, переваренные ферментами, на наличие полос, указывающих на потенциальных отредактированных животных. После выявления потенциальных отредактированных животных используют оставшиеся три микролитра лизиса червей и повторят ПЦР. Затем немедленно загрузите завершенные реакции в 1%-ный агарозный гель перед отделением и извлечением ленты с помощью набора для экстракции геля.

С помощью праймера F1 проведите секвенирование по Сэнгеру для идентификации правильно отредактированных животных. Наконец, получить гомозиготных животных от верифицированных гетерозиготных отредактированных животных, выбрать от 8 до 12 F2 животных и провести генотипирование и верификацию последовательности в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы продемонстрировать простоту, осуществимость и эффективность подхода, основанного на CRISPR/Cas9 RNP, ген C.Elegans sod-1 был нацелен на введение в геном червя человеческого варианта G93a, связанного с заболеванием.

На этом изображении геля представлены результаты генотипирования 24 животных с положительным результатом теста F1 mCherry. 10 содержали моноаллильную или биаллильную модификацию, 10 были дикого типа, три были потенциальными инделами и один был неудачным методом ПЦР. Чтобы продемонстрировать, что флуоресцентный маркер mCherry обогащает геном, было отобрано восемь mCherry отрицательных животных из каждой из трех P0-пластин

Только одно животное было корректно модифицировано, тогда как 23 были дикого типа. На этом рисунке показана хроматограмма полноразмерного ПЦР-продукта, экстрагированного гелем, демонстрирующая, что точные нуклеотидные изменения, разработанные в шаблоне ssODN HDR, были точно включены в геном этого гомозиготного животного F1. После освоения этот метод может быть использован для генерации и идентификации геномных мутаций у C.elegans в течение четырех-пяти дней, если он выполнен правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об использовании реагентов и методов, не содержащих ядер, включая воду, не содержащую РНКазы, наконечники пипеток с фильтром и перчатки. После этой процедуры могут быть выполнены клеточные, молекулярные и поведенческие анализы с целью исследования фенотипов, которые могут быть связаны с интересующей мутацией. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно генерировать геномные точечные мутации у C.Elegans с использованием химерной одиночной направляющей РНКазы и рибонуклеарных белков CRISPR/Cas9.