Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Общая цель данного анализа отпечатков ног заключается в наблюдении за формированием комплекса инициации трансляции на мРНК млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляции мРНК, такие как инициация трансляции с помощью IRES. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно провести детальный анализ формирования комплекса инициации трансляции на конкретной мРНК.

Соберите реакции транскрипции для транскрибирования РНК из амплифицированных ПЦР матриц ДНК, кодирующих XIAP IRES РНК или ее мутанты. Затем добавьте две единицы ДНКазы, свободной от РНКазы, чтобы удалить матрицу ДНК в каждую реакцию РНК объемом 20 микролитров. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем разбавьте обработанную ДНКазой РНК водой, свободной от нуклеазы, до конечного объема 110 микролитров. Далее добавьте 110 микролитров кислотного фенола, чтобы начать очистку РНК. Ввергните образцы в вихрь в течение пяти секунд и центрифугируйте при 20 000 x g в течение трех минут при комнатной температуре.

Очень важно разбавить РНК или КДНК перед экстракцией фенола. Если объем слишком мал, будет трудно физически восстановить водную фазу, и конечный выход будет низким. Затем осторожно перенесите 100 микролитров РНК-содержащей водной фазы в новую микроцентрифужную пробирку.

Добавьте 10 микролитров 3 М ацетата натрия, pH 5,5, и перемешайте образцы. Затем добавьте три объема 100% этанола, чтобы осаждать РНК и закрутить образцы в течение пяти секунд. Инкубировать в течение ночи при температуре 20 градусов Цельсия.

На следующий день центрифугируйте образцы при температуре 20 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте гранулу 500 микролитрами ледяного 70% этанола и повторите центрифугирование. Осторожно отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости, не вытесняя гранулы.

Затем высушите гранулы на воздухе в течение пяти-10 минут. Ресуспендируйте гранулу в воде, не содержащей нуклеаз, до конечной концентрации 0,5 мкг на микролитр. Чтобы начать анализ отпечатка ноги, добавьте 15 микролитров не обработанного нуклеазой лизата ретикулоцитов кролика в каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, которые представляют собой XIAP IRES РНК дикого типа и его мутантов.

Добавьте ингибитор РНКазы, АТФ и GMP-PNP в каждую пробирку. Выдерживать при температуре 30 градусов Цельсия в течение пяти минут. После этого добавьте по одному микролитру соответствующей РНК в каждую из пробирок и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия еще пять минут.

В период инкубации добавьте DTT и спермидин в буфер для отпечатка пальцев ног. Затем добавьте по 22 микролитра буфера для отпечатка пальцев ног в каждую из пробирок и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех минут. Далее добавьте 0,5 микролитра ИК-красителя с маркировкой грунтовки для ног и выдержите реакцию на льду в течение 10 минут.

Затем добавьте два микролитра dNTP, два микролитра ацетата магния и один микролитр обратной транскриптазы вируса птичьего миолобластоза. Доведите итоговый объем до 50 микролитров с помощью буфера для отпечатков пальцев. Затем дайте праймеру проявиться в течение 45 минут при температуре 30 градусов Цельсия.

Также важно добавить ацетат магния в реакцию отпечатка пальца ноги, без которого обратная транскриптаза не будет функционировать оптимально. После этого добавьте 200 микролитров воды, не содержащей нуклеаз. Добавьте 250 микролитров 25:24:1 фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, pH 8,0, чтобы начать очистку кДНК.

После вортексирования образцов в течение пяти секунд центрифугируйте образцы при температуре 20 000 x g при комнатной температуре в течение трех минут. Далее аккуратно перенесите водную фазу, содержащую ДНК, в новую микроцентрифужную пробирку. Затем добавьте три объема 100% этанола, чтобы осаждать ДНК и вихрь в течение пяти секунд.

Инкубировать в течение ночи при температуре 20 градусов Цельсия. На следующий день центрифугируйте пробирки при температуре 20 000 x g в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте гранулу ДНК 500 микролитрами ледяного 70% этанола и центрифугируйте при 20 000 х г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости, стараясь не сместить гранулу. Затем высушите гранулы на воздухе в течение пяти-10 минут. Растворите гранулу ДНК в шести микролитрах воды, не содержащей нуклеаз.

Затем добавьте три микролитра загрузочного красителя формамида. Используйте набор для секвенирования для подготовки лестницы для секвенирования дидезоксинуклеотидов с праймером для отпечатка пальцев ног и конструкцией ДНК, кодирующей РНК XIAP IRES. Затем смешайте по шесть микролитров каждой реакции секвенирования с тремя микролитрами красителя, загружающего формамид.

После чистки и сборки пластин, налейте гель, и вставьте расческу. После полимеризации геля соберите аппарат для секвенирования и заполните резервуары 1x TBE. Затем запустите при напряжении 1500 вольт в течение 15 минут, пока не будет достигнута температура 55 градусов по Цельсию.

Нагрейте все образцы формамидным красителем до 85 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем загрузите по одному микролитру каждого образца в 6%-ный полиакриламидный гель для секвенирования и запустите гель при напряжении 1500 вольт в течение восьми часов. Наконец, считайте каналы в режиме реального времени с помощью флуоресцентного тепловизора.

Этот метод показывает, что подтверждение наличия РНК имеет решающее значение для формирования комплекса инициации трансляции. Обратная транскрипция комплекса мРНК рибосомы XIAP дает типичные отпечатки пальцев ног на 17–19 нуклеотидах ниже по течению от AUG. У мутанта 5'PPT нарушено формирование отпечатков пальцев ног.

Однако при расшифровке с помощью 5'cap происходит образование инициационного комплекса. Аналогичным образом, у мутанта 3'PPT также нарушено формирование отпечатков пальцев ног. Однако транскрипция с 5'cap приводит к образованию инициационного комплекса.

Двойной мутант PPT, несущий мутации 5'PPT и 3'PPT, способен образовывать инициационный комплекс без 5'-капа. Формирование отпечатка пальца ноги сильно нарушено для мутанта стартового кодона в отсутствие RRL и GMP-PNP, а также поли-А хвоста. Продукты CDNA сравниваются с помощью лестницы для секвенирования дидезоксинуклеотидов.

Человеческий бета-глобин, или мРНК HBB, не имеет отпечатка пальца ноги в отсутствие 5'-капсулы. Тем не менее, инициационный комплекс формируется на ограниченном 5'UTR HBB, что дает отпечатки пальцев от 16 до 18 нуклеотидов ниже по течению от AUG. После освоения этой техники ее можно выполнить за три дня, включая подготовку шаблонов транскрипции in vitro и РНК, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как структурное зондирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как вторичная структура дикого типа или мутантных вариантов IRES. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области трансляции мРНК к изучению IRES-опосредованной трансляции in vitro. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять печать мРНК пальцев ног у млекопитающих и анализировать формирование комплексов инициации трансляции.

Не забывайте, что кислотный фенол, фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и акриламид могут быть чрезвычайно опасными. Во время использования этих реагентов следует надевать соответствующие средства индивидуальной защиты.