Инъекции Retroductal наночастиц в мышиных подчелюстной железы

Общая цель этой процедуры заключается во введении наноматериалов непосредственно в мышиную подчелюстную железу. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает прямую доставку соединений в подчелюстную железу в обход системного кровообращения. Применение этой методики распространяется на терапию дисфункции слюнных желез после лучевой терапии злокачественных опухолей головы и шеи.

Как правило, у людей, плохо знакомых с этим методом, может возникнуть проблема с обнаружением и канюлированием подчелюстного протока, пока животное находится под действием седативных препаратов. Чтобы начать эту процедуру, отрежьте три сантиметра трубки внутричерепного катетера 32 калибра со вставленной проволокой, чтобы сформировать скошенный конец примерно под углом 45 градусов к длинной оси. Убедитесь, что провод по крайней мере на один сантиметр длиннее трубки.

Создание скошенного края трубки облегчит канюляцию протоков. Если трубка погнулась во время процедуры, следует обрезать свежий скошенный край. Затем загрузите 50 микролитров раствора наночастиц ПСМА или другого инъекционного материала в шприц Гамильтона.

Чтобы снизить вероятность травмирования норы во время инъекции, прикрепите трубку катетера к шприцу и выведите мертвый объем. Осмотрите раствор для инъекций, чтобы убедиться, что наночастицы полностью растворены и предотвратить обструкцию протоков. Затем приготовьте раствор атропина из расчета 0,1 миллиграмм на миллилитр.

Чтобы визуализировать точку входа в проток, поместите мышь под наркозом в положение лежа на пользовательской рабочей области. Затем нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры. После этого закрепите верхнечелюстные резцы над металлической балкой и с помощью эластичной ленты надавите вниз за резцами нижней челюсти.

Выровняйте мышь под препарирующим микроскопом, чтобы визуализировать основание челюсти. Чтобы расширить рот, используйте специальный изогнутый стальной ретрактор для наложения натяжения слизистой оболочки щек с обеих сторон. Чтобы визуализировать подчелюстное сосочек, захватите и осторожно приподнимите язык от дна рта с помощью тупых щипцов.

Поместите кусочек ваты между языком и слизистой оболочкой щек, чтобы обеспечить дальнейшие манипуляции в ротовой полости. Чтобы выполнить канюляцию протоков и установку катетера, возьмитесь за трубку катетера с проволочной вставкой. Для оптимального ручного контроля во время канюляции выровняйте трубку по кривизне щипцов.

С помощью препарирующего микроскопа переместите щипцы и проволоку в поле зрения. Используя вставку из проволоки, осторожно надавите на основание одного подчелюстного сосочка, чтобы произвести небольшой поверхностный прокол слизистой оболочки, который облегчит последующее введение трубки катетера. При возникновении сопротивления обрежьте острыми ножницами свежие скошенные кончики на трубке и вставке из проволоки.

После записи извлеките стилет, затем с помощью препарирующего микроскопа подтвердите наличие слюны в месте прокола. Затем втяните стилет дальше внутрь трубки. Избегайте сильных или резких движений стилета, которые могут вызвать кровотечение или нарушить целостность протоков.

Чтобы убедиться, что инъекционная трубка войдет в отверстие воздуховода Уортона, вставьте трубку, содержащую стилет в качестве жесткой направляющей, в ранее сделанный прокол. Чтобы предотвратить длительное противодавление и обструкцию протоков, извлеките трубку. Под микроскопом убедитесь, что в подчелюстном сосочке видно отверстие.

При появлении видимого кровотечения удалите стилет и повторите процедуру на противоположном подчелюстном сосочке. Далее, не двигая мышью, введите один миллиграмм на килограмм раствор атропина внутрибрюшинно, чтобы уменьшить возвышение во время процедуры. Затем подождите от пяти до 10 минут.

Под рассекающим микроскопом вставьте трубку шприца в отверстие. Если вы столкнулись с сопротивлением, отрежьте на трубке свежий скошенный конец и повторите попытку. Как только трубка будет установлена в подчелюстном сосочке, медленно продвигайтесь на три-пять миллиметров внутрь протока.

Затем освободите трубку от щипцов. Чтобы улучшить уплотнение между трубкой и подчелюстным сосочком, высушите место соприкосновения, аккуратно промокнув марлей в течение одной минуты. Осмотрите и убедитесь, что положение трубки не сместилось во время сушки.

При этой процедуре вводят материал со скоростью 10 микролитров в минуту. Убедитесь, что мышь остается под действием седативных препаратов и не проявляет признаков недомогания. После инъекции поддерживайте давление в шприце в течение пяти минут, чтобы улучшить удержание материала в протоке Уортона и подчелюстной железе.

Периодически осматривайте подчелюстной сосочек, чтобы убедиться, что трубка не выходит из протокового отверстия. Поддержание давления впрыска повысит эффективность ретродукальной доставки. С помощью тонких щипцов аккуратно захватите и извлеките трубку из подчелюстного сосочка.

Удалите втягивающее устройство и вату из ротовой полости, прежде чем убрать мышь от рабочей области. Чтобы проверить доставку наночастиц, система визуализации in vivo показывает латерализацию красного флуоресцентного сигнала на обработанную сторону мыши через час после инъекции. И на этом изображении видно, что сигнал наночастиц значительно снизился через 24 часа после инъекции.

Чтобы подтвердить стойкость наночастиц в подчелюстных железах через 24 часа после инъекции, их разрезали и просматривали с помощью флуоресцентной визуализации. Здесь показаны неинъецированные контрольные подчелюстные железы, окрашенные на аквапорин 5 и керитин 5, маркирующие секреторные ацинусы и протоковые клетки соответственно. В ретродуктивных подчелюстных железах, вводимых наночастицами, аквапорин 5 и керитин 5 демонстрируют нормальную морфологию желез и наночастицы, поглощаемые как ацинусами, так и протоками.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 20 минут, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости избегать любых посторонних движений, которые могут сместить канюлю или нарушить уплотнение, образованное между трубкой и подчелюстным сосочком. После процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноокрашивание, экстракция РНК или проточная цитометрия, чтобы оценить экспрессию генов или локализацию наноматериала в подчелюстной железе.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям слюнных желез к скринингу и тестированию соединений для профилактики ксеростомии. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как вводить наноматериалы непосредственно в подчелюстную железу мыши через канюляцию протока Уортона.