Оценка экзона включение индуцированных сращивания переключения антисмысловых олигонуклеотидов в фибробластов SMA пациента
11 мая 2018 г.
Различные антисмысловых олигонуклеотидов (AONs) было показано, чтобы побудить экзона включение (соединитель модуляции) и спасти SMN выражение для спинальной мышечной атрофии (SMA). Здесь мы описываем протокол для AON lipotransfection побудить включение экзона гена SMN2 и методы оценки для определения эффективности в пациента фибробластов SMA.
Общей целью данного протокола липотрансфекции является введение антисмысловых олигонуклеотидов в клетки и оценка эффективности этих препаратов по включению экзонов в клетки СМА. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области антисмысловой терапии. Например, эффективность новых антисмысловых олигонухотентов для обеспечения лечения пациентов.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она быстра, проста и достаточно чувствительна для тестирования различных химических составов антисмысловых олигонуклеотидов. Хотя этот метод может быть использован для трансфекции антисмысловых олигон в фибробласты, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как первичные миобласты и различные другие клеточные линии. Демонстрировать процедуру будет Алекс, техник из моей лаборатории.
Сначала разморозьте 10 микромолярный раствор смесителя LNA/ДНК на льду. Раствор смесителя развести в среде, лишенной сыворотки, до необходимой концентрации в тубе объемом 1,5 миллилитров. Далее разведите реагент для трансфекции и добавьте разведенный реагент для трансфекции в смеситель в соотношении один к одному.
Очень важно, чтобы слияние клеток составляло от 65 до 80% во время трансфекции. Если слияние превышает 80%, эффективность трансфекции будет снижена. Затем инкубируйте смесь реагентов для трансфекции при комнатной температуре в течение 10 минут.
Через 10 минут пипетку нанесите в пробирку 900 микролитров лишенной сыворотки сыворотки с 5%-ной фетальной бычьей сывороткой. Не добавляйте FBS перед инкубацией с реагентом для трансфекции и смесителями LNA/DNA, так как это также влияет на эффективность трансфекции. Затем отсасывайте старую среду из тарелки для культуры.
Теперь добавьте один миллилитр среды, содержащей смеситель LNA/DNA, в планшет для культивирования. Затем оставьте пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на 24-48 часов. После инкубации отсасывайте среду из культуральной тарелки.
Затем пипетируйте один миллилитр реагента GPC в клетки. Далее несколько раз промойте лунки реагентом ГПК. После нескольких промывок соберите клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитра и держите образцы на льду.
Далее двигайтетрубку вихрем на высокой скорости в течение 30 секунд. Затем храните тюбик при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение часа. Теперь разморозьте образец при комнатной температуре и быстро сделайте его вихрем.
Далее добавьте в пробу 200 микролитров хлороформа и энергично встряхивайте его в течение 15 секунд. Затем выдержите трубку при комнатной температуре в течение трех минут. Через три минуты центрифугируйте образец при 12 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
После завершения центрифугирования соберите водную фазу с верхней части центрифужной пробирки. Затем переведите водную фазу в новую пробирку. Далее добавьте 500 микролитров изопропанола и один микролитр восьми микрограммов на микролитр гликогена класса РНК в водную фазу.
Быстро ввергните образец в вихрь в течение 10 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации образец центрифугируют при 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость после окончания прогона.
Добавляем один миллилитр холодного 75%-ного этанола и кратковременно вортсом промываем полученную гранулу. Снова центрифугируйте образец при 7500 g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем изгоните весь этанол и высушите гранулы при комнатной температуре.
После того, как гранула высохнет, растворите ее в 30 микролитрах воды, свободной от ДНКазы/РНКазы. Затем инкубируйте образец при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. Далее считайте концентрацию РНК на уровне 260 нанометров в спектрофотометре и отрегулируйте ее до 15 нанограмм на микролитр.
Чтобы составить мастер-смесь ОТ-ПЦР, добавьте два реакционных буфера X RT-PCR, одноступенчатую смесь ферментов ОТ-ПЦР, прямые и обратные праймеры и дистиллированную воду, свободную от РНК/ДНКазы. Распределите мастер-смесь по 0,2-миллиметровым ПЦР-пробиркам и добавьте общее количество РНК для каждого соответствующего образца. Затем запустите реакцию ПЦР.
После завершения ОТ-ПЦР добавьте в амплифицированный продукт пять микролитров шести загрузочных красителей X. Затем загрузите пять микролитров смеси в 2%-ный агарозный гель. Запустите установку электрофореза при напряжении 100 вольт на 40 минут.
Во-первых, изучается эффективность различных смесителей. Для этого анализируют включение уровней 7-го экзона SMN2 и GAPDH в фибробласты СМА, трансфицированные миксмерами. На изображении геля показано включение экзона 7, где верхняя и нижняя полосы представляют включенную и исключенную РНК SMN2 экзона 7.
Эффективность включения также оценивается в диапазоне от 78 до 98% при трансфекции миксмерами от одного до пяти. С другой стороны, при использовании смесителя от шести до восьми для трансфекции фибробластов СМА пациента не получено существенных результатов по сравнению с контролем. В эксперименте в качестве контроля используется GAPDH.
Затем проводится количественная ПЦР для анализа относительной экспрессии полноразмерного SMN2 по сравнению с GAPDH. Резкое увеличение количества транскрипта SMN2 наблюдается при трансфекции миксмерами с первого по третий и пятый по сравнению с контролем. Также изучается уровень экспрессии белка SMN, который показывает увеличение уровня экспрессии белка SMN у пациента, трансфицированного миксмерами от одного до пяти.
Наблюдается резкое увеличение уровня белка SMN в 1,5-1,9 раза. В данном случае используется контроль за соблюдением кофилина. Напротив, смесители с шести по восемь не изменяют уровень экспрессии белка SMN.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансфектировать антисмысловое олиго в фибробласты и оценить эффективность in vitro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол липотрансфекции для введения антисмысловых олигонуклеотидов (AON) в клетки с целью индукции включения экзона в гене SMN2 для лечения спинальной мышечной атрофии (СМА). Эффективность этого метода оценивается на фибробластах пациентов с СМА.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генетика
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Спинальная мышечная атрофия (СМА) — это генетическое заболевание, поражающее мотонейроны.
- Антисмысловые олигонуклеотиды могут модулировать сплайсинг и восстанавливать экспрессию SMN.
- Эффективные методы доставки AON имеют решающее значение для терапевтического применения.
- Данный протокол позволяет тестировать различные химические модификации AON.
Цель исследования
- Для эффективного введения AON в клетки при СМА.
- Для оценки эффективности AON в индуцировании включения экзонов.
- Для обеспечения быстрого и чувствительного метода тестирования AON.
Используемые методы
- Липотрансфекция антисмысловых олигонуклеотидов в фибробласты.
- Оценка включения экзона в гене SMN2.
- Применение метода к различным типам клеток, включая первичные миобласты.
- Демонстрация процедуры лабораторным техником.
Основные результаты
- Метод липотрансфекции эффективен для доставки AON.
- Удалось успешно индуцировать включение экзона в гене SMN2.
- Протокол может быть адаптирован для различных типов клеток.
- Результаты подтверждают потенциал AON в качестве средства лечения СМА.
Заключение
- Данный протокол липотрансфекции является ценным инструментом для исследований в области антисмысловой терапии.
- Он позволяет быстро проверить эффективность AON в клетках при СМА.
- В будущих исследованиях этот метод может быть расширен для изучения новых AON.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет проводить быстрый и чувствительный анализ эффективности антисмысловых олигонуклеотидов (AON) в индуцировании включения экзона SMN2 в фибробластах, полученных от пациентов, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и идентификации ведущих соединений для терапии, модулирующей сплайсинг. Путем количественного определения включения экзона и восстановления уровня белка при низких концентрациях AON метод обеспечивает прогностическую уверенность при приоритизации кандидатов с повышенной активностью и сниженным профилем токсичности. Адаптивность данного метода к различным типам клеток и химическим составам облегчает снижение рисков на доклиническом этапе и обеспечивает трансляционную преемственность в процессах разработки препаратов для лечения СМА.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтическую гипотезу путем измерения эффективности включения 7-го экзона SMN2 в качестве функционального показателя взаимодействия с мишенью.
- Операционная ценность: Использует RT-PCR и qPCR для количественного определения включения экзонов и уровней транскриптов, обеспечивая воспроизводимые количественные данные для валидации мишени.
- Прогностическая ценность: Демонстрирует дозозависимое восстановление белка SMN с помощью вестерн-блоттинга, что способствует механическому снижению рисков и сортировке кандидатов из группы AON.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создает рабочий процесс на основе липотрансфекции, совместимый с высокопроизводительным тестированием различных химических структур AON, включая миксмеры LNA/DNA.
- Воспроизводимость: Стандартизирует условия трансфекции (конфлюэнтность 65–80%, соотношение реагентов) и нормализацию по контролям GAPDH и кофилину, что обеспечивает согласованность результатов между разными экспериментами.
- Масштабируемость: Совместимость с первичными миобластами и другими клеточными линиями позволяет использовать платформу в различных моделях соответствующих заболеваний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Использование фибробластов пациентов с СМА позволяет сохранить генетическую и фенотипическую точность, что повышает трансляционную валидность данных скрининга AON.
- Преклиническая преемственность: Установление связи между включением экзона и экспрессией белка SMN создает механистический мостик от модуляции молекулярной мишени к функциональному восстановлению фенотипа.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основании эффективности включения экзона (78–98%) и кратности изменения уровня белка (1,5–1,9), что снижает биологические риски на поздних стадиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки: от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что позволяет проводить итеративную проверку эффективности AON перед исследованиями in vivo.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез о механизмах переключения сплайсинга путем количественного определения включения экзонов и исключения нецелевых эффектов с помощью нормализации по GAPDH.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа и количественные показатели (% включения экзонов, кратность изменения транскрипта) для надежной оценки соединений с различной химической структурой AON.
- Аналитика: Позволяет получать измеримые результаты (количественный анализ полос RT-PCR, относительная экспрессия qPCR, уровни белков по данным вестерн-блоттинга) для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярную эффективность с восстановлением белка в клетках пациентов, обеспечивая согласованность биомаркеров и преемственность доклинических исследований.
- Корпоративное использование: Устанавливает стандартизированный протокол липотрансфекции, применимый к различным типам AON и клеточным системам, что сокращает необходимость в повторной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени посредством прямого измерения включения экзона и восстановления белка SMN.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию, воспроизводимость и чувствительность при тестировании различных химических модификаций AON в низких концентрациях.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет установления связи между эффективностью включения экзона и экспрессией белка, что снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов AON с учетом рисков на основе количественных порогов эффективности.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с нуклеиновыми кислотами, оптимизации трансфекции, а также анализа РНК и белков.
- Зависимость от совместимости реагентов для трансфекции, наличия спектрофотометра для количественного определения РНК, а также оборудования для гель-электрофореза, qPCR и вестерн-блоттинга.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима межкомандная стандартизация условий трансфекции (степень конфлюэнтности, соотношение реагентов) и нормализация контролей (GAPDH, кофилин).
- Адаптация метода для первичных миобластов или других клеточных линий может потребовать оптимизации эффективности трансфекции и оценки цитотоксичности.
- Практические ограничения включают вариабельность номера пассажа фибробластов пациентов и необходимость сохранения целостности РНК в процессе экстракции.
