Однородное время решены Фёрстер резонанс энергии на основе передачи Assay для обнаружения секреции инсулина

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы индуцировать и точно количественно определить уровни секретируемого инсулина из клеток, секретирующих инсулин. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диабета, такие как основные механизмы стимуляции глюкозой секреции инсулина в бета-клетках поджелудочной железы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может точно и быстро количественно оценить секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой и обнаружить потенциальное влияние препарата на секрецию.

Применение этого метода распространяется на терапию и открытие лекарств для лечения диабета 2 типа, потому что это позволит нам лучше понять механизмы метаболической дисфункции, вызванной лекарствами. Хотя этот метод может дать представление о секреции инсулина из иммортализованных линий бета-клеток, он также может быть применен к другим системам, таким как интактные островки поджелудочной железы. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за нескольких этапов обработки клеток и подготовки лекарств.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели придумать быстрый анализ для исследования действия дофаминергических препаратов на секрецию инсулина. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы работы с клетками сложны для изучения из-за хрупкой природы клеток и важности точности для обеспечения согласованности анализа между экспериментами. Во-первых, вырастите клетки INS-1E, как описано в текстовом протоколе.

Как только клетки достигнут желаемого слияния, аспирируйте среду. Промойте клетки пятью миллилитрами фосфатного буферного раствора. Далее добавьте в клетки 0,5 миллилитра 025% трипсина, после чего оставьте клетки в инкубаторе на три-четыре минуты при температуре 37 градусов Цельсия.

Деактивируйте трипсин, добавив девять миллилитров полной среды. Далее переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки для формирования гранулы.

После центрифугирования растворите гранулу в пяти миллилитрах свежей среды. Выведите пипеткой 10 микролитров повторно суспензированных клеток из пробирки и смешайте с 10 микролитрами трипанового синего жизненно важного красителя для оценки жизнеспособности. Затем с помощью гемоцитометра подсчитайте количество живых и мертвых клеток и убедитесь, что 90% клеток являются живыми.

После подсчета добавьте один миллион клеток на миллилитр в свежую среду RPMI 1640, затем засейте 0,5 мл 500 000 клеток INS-1E в каждую лунку 24-луночного планшета, покрытого поли-L-лизином. Оставьте тарелку в инкубаторе на целый день. На следующий день удалите среду и добавьте по 500 микролитров свежей среды RPMI 1640 в каждую из лунок.

Инкубируйте планшет еще 24 часа, чтобы клетки распространились по поверхности лунки. Для проведения анализа сначала готовят буфер KRB, затем отсасывают среду из каждой лунки и дважды промывают предварительно подогретым фосфатным буферным раствором. Затем добавьте в каждую лунку по 450 микролитров буфера KRB, дополненного бычьим сывороточным альбумином, но без глюкозы.

Оставьте культуральную пластину при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на час. Готовьте серийные разведения препаратов в буфере KRB, дополненные 10-кратной конечной концентрацией 200 миллимолярной глюкозы. После этапа глюкозного голодания пипеткой в каждую из соответствующих лунок впрыскиваем по 50 микролитров серийно разведенных препаратов.

Для стимуляции глюкозой добавляют соответствующие серийно разведенные препараты в присутствии 20 миллимолярной глюкозы. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут. Как только стимуляция закончится, соберите надосадочную жидкость и перенесите их в пробирки с маркированными центрифугами объемом 1,5 миллилитров.

Перелейте по 10 микролитров каждого собранного надосадочной жидкости в 96-луночный планшет. Добавьте 90 микролитров KRB в каждую лунку, чтобы достичь соотношения разбавления один к 10. Смешайте разбавления для обеспечения однородности.

Затем получите стандартную кривую инсулина для анализа на инсулин HTRF. Затем добавьте по 10 микролитров каждого из стандартных образцов инсулина и разведенных надосадочных добавок в 96-луночный планшет. Приготовьте смесь антител в одном или двух донорах, чтобы принять соотношение в буфере обнаружения.

После приготовления смеси антител добавьте по 30 микролитров ее в каждую из лунок в 96-луночную пластину. Закройте пластину и инкубируйте при комнатной температуре. После двухчасовой инкубации считайте показания планшета со смесью антител на считывателе планшетов.

Используйте для считывания соответствующий оптический модуль HTRF на 665 и 620 нанометрах и используйте 200 вспышек для каждой лунки. Во-первых, строится стандартная кривая инсулина для экстраполяции фактических значений инсулина из образцов анализов. Стандартная кривая показывает, что полученные показания ратиометрической флуоресценции значительно увеличиваются в зависимости от заданных стандартных концентраций инсулина человека.

Далее изучается базальный уровень секреции инсулина из клеток INS-1E в присутствии или отсутствии 20 миллимолярной глюкозы. Из графика видно, что клетки выделяют примерно 100 нанограммов на миллилитр инсулина в присутствии глюкозы. Интересно, что уровень инсулина составляет почти половину и составляет примерно 15 нанограммов на миллилитр в отсутствие глюкозы.

Далее клетки инкубируются в присутствии возрастающих концентраций дофамина с 20 миллимолярной глюкозой. Выделяемый инсулин нормализуется до среднего значения максимального процента инсулина из каждой лунки. На графике показано, что дофамин ингибирует GSIS, тем самым указывая на функциональную важность дофаминергических рецепторов в GSIS.

Этот график показывает, что бромокриптин, лекарство от диабета 2 типа, обладает большей силой в индуцировании GSIS, чем дофамин. Этот график показывает, что с увеличением концентрации квинпирола агонист D2, хотя и менее эффективный, чем бромокриптин, проявляет такую же активность, как допамин, в стимуляции GSIS. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре-пять часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости проводить пипетку осторожно и последовательно. После этой процедуры могут быть проведены другие функциональные анализы, такие как циклический анализ АМФ HDRF, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние дофаминергических препаратов на нисходящую передачу сигналов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области метаболизма к изучению других эндокринных секреторных путей как в иммортализированных клеточных линиях, так и в островках поджелудочной железы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно измерить секрецию инсулина из клеток с помощью HDRF.