Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

Общая цель этого метода заключается в использовании иммуномагнитной изоляции для отбора O4-положительных олигодендроцитов у новорожденных мышей для анализа их культуры in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронауки, связанные с изучением заболеваний, влияющих на миелин и миелинизацию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он облегчает получение окончательной культуры олигодендроцитов чистоты более 80% примерно за час часов.

Начните с использования небольших ножниц для препарирования, чтобы разрезать кожу вдоль средней линии кожи головы мыши через пять-семь дней после рождения. Втяните кожный лоскут, чтобы обнажить череп, и аккуратно разрежьте череп по средней линии от отверстия в задней части до лобной области. От отверстия в задней части черепа разрежьте по направлению к каждой глазнице вдоль основания кости и с помощью тонких щипцов аккуратно отодвиньте кору головного мозга от среднего мозга.

Затем перенесите кору головного мозга в 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую семь миллилитров нейробазальной среды B-27. Когда все мозги будут собраны, перенесите кору головного мозга в новую 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую пять миллилитров буфера диссоциации, и используйте лезвие скальпеля под номером 15, чтобы нарезать кору на один кубик миллиметра. Инкубируйте части мозга в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Затем добавьте один миллилитр сыворотки для роста крупного рогатого скота, чтобы остановить ферментативную реакцию. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров переложите тканевую суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров и аккуратно диссоциируйте ткань мозга от шести до восьми раз с помощью пипетирования. Дайте диссоциированным тканевым кусочкам осесть в течение двух-трех минут.

Затем переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Затем добавьте в ткани три миллилитра нейробазальной среды А, дополненной сывороткой для роста крупного рогатого скота и ДНКазой I, и используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы аккуратно диссоциировать ткани с помощью большего количества пипетирования. Дело в том, что соответствующее усилие пипетирования имеет решающее значение для обеспечения высокого выхода жизнеспособных клеток.

Если пипетирование слишком сильное, жизнеспособность может быть низкой. В то же время, если пипетирование слишком щадящее, выход клеток может быть низким. Дайте кусочкам салфетки осесть еще две-три минуты.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и добавьте в ткань три миллилитра свежей нейробазальной среды А, дополненной сывороткой для роста крупного рогатого скота и ДНКазой I. Аккуратно диссоциируйте мозговую ткань с помощью наконечника пипетки P-1000 до тех пор, пока не останется большого куска ткани, стараясь не допустить образования пузырьков. С помощью пипетки объемом 10 миллилитров отфильтруйте клеточный раствор через сетчатое фильтр для клеток 70 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и доведите окончательный объем одноклеточной суспензии до 30 миллилитров с помощью свежей нейробазальной среды А, дополненной сывороткой для роста крупного рогатого скота и ДНКазой I. Разделите клеточную суспензию на две конические пробирки по 15 миллилитров, и гранулировать нервные клетки путем центрифугирования.

Удалите все, кроме последних 5-10 микролитров мутной надосадочной жидкости, и добавьте в клетки три миллилитра нейробазальной среды А, дополненной сывороткой для роста крупного рогатого скота. Осторожно повторно суспензируйте клеточные гранулы и доведите конечный объем до 15 миллилитров с помощью свежей нейробазальной среды А, содержащей 10% сыворотки роста крупного рогатого скота. Отфильтруйте клеточный раствор через клеточный фильтр 40 микрон в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров и доведите окончательный объем до 30 миллилитров с помощью свежей нейробазальной среды А, содержащей 10% сыворотки роста крупного рогатого скота.

Затем разделите отфильтрованную клеточную суспензию между двумя 15-миллилитровыми коническими пробирками для центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в 2,5 миллилитрах ледяного магнитного буфера для сортировки клеток перед объединением клеток. После подсчета снова центрифугируйте ячейки и снова суспендируйте гранулу в 90 микролитрах свежего буфера для сортировки магнитных элементов из расчета от 10 до 7 клеток.

Затем добавьте 10 микролитров бусин анти-04 из расчета один умножить на 10 на семь ячеек и перемешайте раствор клеток, осторожно перемешивая их. Через 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия с легким помахиванием каждые пять минут аккуратно добавьте два миллилитра буфера для сортировки магнитных элементов из расчета 10 раз на семь клеток для промывки центрифугированием и выбросьте надосадочную жидкость с помощью тщательной вакуумной аспирации. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежего буфера для сортировки магнитных элементов из расчета от 10 до семи ячеек и поместите колонку для сортировки магнитных гранул соответствующего размера в соответствующий магнитный сепаратор.

Поместите фильтр 40 микрон на колонку и предварительно промойте фильтр тремя миллилитрами буфера для сортировки магнитных элементов, позволяя буферу пройти через колонку, не давая колонке высохнуть. Добавьте ячейки в ситечко, а затем промойте один миллилитр с помощью магнитного буфера для сортировки элементов. Промойте колонку три раза тремя миллилитрами буфера для сортировки магнитных элементов на одну промывку и один раз средой для пролиферации олигодендроцитов.

Затем переложите колонку в 15-миллилитровую трубку и с помощью поршня немедленно промывайте через колонку пять миллилитров свежей среды для пролиферации олигодендроцитов. После подсчета разбавьте клетки до соответствующей плотности покрытия и замените ламинин из предварительно покрытых покровных стекол в 24-луночном планшете 100 микролитрами среды для пролиферации олигодендроцитов. Инкубируйте олигодендроциты при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 не более 45 минут, чтобы обеспечить адгезию олигодендроцитов к покровным стеклам.

Затем заполните каждую лунку 24-луночного планшета 500 микролитрами среды для пролиферации олигодендроцитов для 24-часовой инкубации. На следующий день замените надосадочную жидкость средой для дифференцировки олигодендроцитов и верните клетки в инкубатор до тех пор, пока они не будут готовы к фиксации. Через 24 часа после нанесения покрытия клетки выглядят биполярными или триполярными при фазово-контрастной микроскопии, что является характерной особенностью пролиферации олигодендроцитов на ранней стадии.

Иммунофлуоресцентное окрашивание показывает, что через 24 часа после нанесения покрытия большинство этих пре-олигодендроцитов также демонстрируют мечение NG2 и O4, в то время как мечение GFAP и антителами против 01 встречается гораздо реже, что позволяет предположить, что большинство клеток на этой стадии ae имеют пре-олигодендроциты с небольшим количеством незрелых или зрелых олигодендроцитов. Через 72 часа морфология олигодендроцитов кажется более сложной, чем через 24 часа, и наблюдается гораздо более низкая частота клеток, положительных на ранний маркер олигодендроцитов, NG2. Кроме того, большинство клеток демонстрируют мечение O4, и почти половина клеток окрашена на антитело 01 на этой стадии, что позволяет предположить, что клетки дифференцируются в более зрелый фенотип.

Примечательно, что присутствие астроцитов остается крайне низким. Эти результаты указывают на то, что со временем иммуномагнитно изолированные олигодендроциты способны дифференцироваться in vitro в третью стадию созревания с очень небольшим загрязнением других типов клеток, таких как астроциты. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить первичные олигодендроциты из новорожденных детенышей мышей с помощью иммуномагнитной изоляции.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.