Запись и модуляция активности эпилептиформный ломтиками грызунов мозга в сочетании с микроэлектродные массивы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейромодуляции для лечения эпилепсии, например, какая область мозга и протокол стимуляции лучше всего подходят. Основное преимущество этой методики заключается в том, что срезы мозга грызунов представляют собой упрощенную, реалистичную модель цепей мозга, в то время как микроэлектродные матрицы позволяют вести наблюдение за несколькими точками наблюдения на известном расстоянии между электродами. Для приготовления МЭА равномерно распределите эластомерный герметик по нижней поверхности записывающей камеры, и убедитесь, что на ней нет пузырей.

Затем установите записывающую камеру на MEA с помощью пинцета и слегка надавите. Нанесите слой герметика вокруг внешней границы записывающей камеры. Затем поместите узел MEA/камеры в закрытое влажное помещение и дайте ему застыть при комнатной температуре в течение ночи.

Чтобы подготовить настольный стенд для звукозаписи, установите теплую ванну на 32 градуса Цельсия. Далее заливаем холдинговые АКНС в камеры выдержки и предварительного прогрева. Пузырьки растворов с 95% кислородом и 5% углекислым газом и удалите все захваченные пузырьки с помощью перевернутой пастеровской пипетки.

Поддерживайте камеру хранения при комнатной температуре, а камеру предварительного прогрева поместите в теплую ванну. Приготовьте горизонтальные срезы гиппокампа и коры головного мозга в соответствии со стандартными процедурами и дайте им восстановиться в камере хранения при комнатной температуре в течение не менее 60 минут. Залейте 4AP ACSF в инкубационную камеру.

его смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа и удалите все захваченные пузырьки с помощью перевернутой пастеровской пипетки. Впоследствии накройте камеру, и перенесите ее в теплую ванну. Убедитесь, что температура предварительного нагрева ACSF и 4AP ACSF составляет от 30 до 32 градусов по Цельсию.

С помощью пипетки Пастера из перевернутого стекла перенесите один срез мозга в камеру предварительного нагрева и дайте ткани отдохнуть от 25 до 30 минут. Затем перенесите срез мозга в инкубационную камеру 4AP ACSF и дайте ему отдохнуть в течение 60 минут. Дайте 4AP ACSF течь через перфузионную трубку в стакан до тех пор, пока внутри не останется воздуха.

Затем остановите поток раствора. Поместите сухую микросхему MEA внутрь усилителя MEA и закрепите головку усилителя. Затем с помощью пластиковой дозатора Пастера подайте 4AP ACSF во входной и выходной резервуар записывающей камеры.

Закрепите нагревательную канюлю на магнитном держателе и поместите ее наконечник внутрь входного отверстия записывающей камеры. Затем прикрепите магнитный держатель к магнитной полосе на головке усилителя MEA. Подсоедините перфузионную трубку к канюле, а канюлю к термостату.

После этого поместите всасывающую иглу в выпускной резервуар. Убедитесь в наличии отрицательного давления, погрузив всасывающую иглу в ACSF, и проверьте наличие постоянного низкочастотного шума всасывания. Затем установите регулятор потока так, чтобы он обеспечивал скорость потока один миллилитр в минуту, и начните перфузицию.

Как только 4AP ACSF пройдет через канюлю, включите термостат. Установите нагревательную канюлю на 37 градусов Цельсия, а основание MEA на 32 градуса Цельсия, чтобы достичь температуры от 32 до 34 градусов Цельсия внутри записывающей камеры. Затем поместите внешний электрод сравнения во входной резервуар записывающей камеры.

Как только уровень 4AP ACSF и температура записи стабилизируются по желанию, поверните перфузионные и всасывающие запорные краны в выключенное положение, чтобы временно остановить их. Быстро перенесите один срез мозга в записывающую камеру MEA с помощью пипетки Пастера из перевернутого стекла. При необходимости отрегулируйте его положение на области записи MEA с помощью отполированной огнем изогнутой пипетки Пастера или мягкой компактной небольшой кисти.

Поместите прижимной якорь на срез мозга. Возобновите перфузию и всасывание, вернув их запорные краны во включенное положение. Сфотографируйте срез мозга с помощью камеры, установленной на перевернутом предметном столике микроскопа.

Затем запустите скрипт mapMEA в компьютерном программном обеспечении, чтобы запустить графический интерфейс для отображения электродов. Нажмите кнопку «Обзор», чтобы загрузить изображение среза мозга. Убедитесь, что электрод сравнения находится в верхней колонке левой половины MEA.

Затем нажмите кнопку «Активировать указатель». Выберите верхний и нижний электроды в крайнем левом столбце массива, чтобы отметить XY-координаты для выпрямления изображения и наложения электродов. В раскрывающемся меню типа среза выберите По горизонтали.

Установите флажок Структуры по умолчанию. С помощью пронумерованных кнопок под изображением среза мозга выберите электроды, соответствующие ROI, и нажмите соответствующие кнопки на структурной панели, чтобы назначить их. Повторите этот шаг для каждого ROI.

После этого нажмите кнопку «Сохранить». Программное обеспечение сгенерирует папку с результатами, содержащую таблицу с информацией о выбранных электродах и ROI. Для исследования электрофизиологии включите стимульный блок не менее чем за 10 минут до начала сеанса стимуляции, чтобы обеспечить самокалибровку и стабилизацию.

Затем запустите программное обеспечение для управления стимулами и убедитесь, что стимулятор и усилитель MEA правильно подключены, на что указывает зеленый светодиод на главной панели программного обеспечения для управления стимулами. Настройте стимуляцию в биполярной конфигурации. Подключите блок стимула к земле.

Затем соедините пары электродов, соприкасающиеся с пирамидальным ячеистым слоем CA1/проксимального субикулума, среди тех, которые отображены с помощью скрипта mapMEA. Чтобы получить данные, нажмите кнопку воспроизведения на главной панели программного обеспечения для записи. Запишите не менее четырех иктальных разрядов.

Затем проведите быстрый тест на вход/выход, чтобы определить наилучшую интенсивность стимула. Для этого с помощью главной панели сконструируется квадратный двухфазный импульс положительно-отрицательного тока длительностью 100 микросекунд на фазу. На вкладке «Амплитуда импульса» введите начальную амплитуду импульса 100 микроампер на фазу.

Установите импульс стимуляции на частоте 0,2 Гц или ниже, добавив межимпульсный интервал в пять секунд или дольше. Увеличивайте амплитуду стимула на 50-100 микроампер с каждым испытанием до тех пор, пока стимуляция не сможет надежно вызывать интериктальные события в коре парагиппокампа. Для электрической модуляции лимбического иктогенеза запрограммируйте блок стимула на подачу интересующего протокола стимуляции и используйте амплитуду стимула, определенную во время теста входа/выхода.

После прекращения стимуляции проверьте восстановление сети до состояния, предшествующего стимулированию, записав не менее четырех иктальных разрядов. На этом рисунке представлены записи 4AP-индуцированной иктальной активности в энторинальной коре и периринальной коре в контрольном состоянии, периодической стимуляции с частотой в один герц и во время восстановления после снятия стимула. На этом графике показана количественная оценка эффекта периодической стимуляции на частоте в один герц, что свидетельствует о значительном сокращении общего времени стимуляции во время стимуляции.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно быстро и правильно разместить срез мозга на МЭА. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фармакологические манипуляции, чтобы ответить на дополнительные вопросы о вкладе нейротрансмиттеров или ионного канала в эпилептиформную активность и в эффект нейромодуляции.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению взаимодействия нейронных сетей в здоровье и болезни в культурных нейронах, а также в срезах мозга. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как регистрировать и электрически модулировать эпилептиформную активность, индуцированную четырьмя аминопиридином в срезах мозга грызунов, связанных с MEA.