Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях
11 августа 2018 г.
Здесь мы предоставляем демонстрация модели кожный отозвания всасывания волдыря. Модель позволяет простой доступ для изучения человека в естественных условиях адаптивного иммунного ответа, например в контексте разработки вакцины.
Общая цель этого видео — продемонстрировать метод всасывания кожного вспышного волдыря, который позволяет нам собирать антиген-специфические Т-клетки и цитокины, представляющие адаптивный иммунный ответ in vivo. Этот метод может быть использован для изучения клеточных реакций и адаптивного иммунитета у человека. Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она позволяет собирать антиген-специфические Т-клетки непосредственно из места иммунной реакции с помощью относительно неинвазивного и безопасного метода.
Основной принцип кожного восстановления заключается в депонировании антигена в дермальном слое кожи. У людей с существующей иммунологической памятью антигена Т-клетки мигрируют к месту реакции и вызывают местный иммунный ответ, при котором специфические Т-клетки клонально расширяются и дифференцируются in situ. Индукция всасывающих волдырей в этой реакции позволяет нам собирать эти специфические Т-клетки, а также цитокины, производимые in vivo.
В этой видеодемонстрации мы используем PPD в качестве антигена отзыва. ППД обычно используется для диагностики инфекции микобактерий туберкулеза. Но он также вызывает кожные реакции у людей, ранее вакцинированных вакциной БЦЖ, как вы увидите в этом видео.
Материалы для туберкулиновой кожной пробы включают спиртовые тампоны, одномиллилитровый шприц с короткой иглой от 27 до 30 калибра и раствор PPD, одобренный для использования человеком. Используйте раствор ППД из расчета 20 туберкулиновых единиц на миллилитр. Продезинфицируйте флакон с помощью спиртового тампона.
И обратите внимание, что состав может отличаться у разных производителей. Затем найдите место инъекции на вентральной стороне предплечья добровольца и продезинфицируйте эту область с помощью спиртового тампона. Используйте стерильный шприц объемом один миллилитр с неподвижной иглой 29 калибра 12 миллиметров.
Аккуратно перемешайте и припейте 0,1 миллилитра раствора PPD. Следите за тем, чтобы там не было видимых пузырей. Напрягите кожу и направьте иглу под углом от пяти до пятнадцати градусов фаской вверх.
Введите кончик иглы в дермальный слой кожи и убедитесь, что кончик почти виден через эпидермис. Медленно введите 0,1 миллилитра раствора PPD. При правильном введении папула в шесть-десять миллиметров появится сразу.
Папула исчезает примерно через десять минут. Многократное отложение ПРД возможно, но может потребовать дополнительного этического одобрения. Если вводится две инъекции, стремитесь к максимальному разделению, находясь на достаточном расстоянии от области локтя и запястья.
Клиническая кожная реакция проявляется в течение первых 24 часов и сопровождается ощущением зуда. Измерьте величину кожной реакции через 48–72 часа после инъекции. При оценке реакции важно измерять уплотнение, а не эритему.
Пропальпируйте шляпку отека с помощью пальца. Затем отметьте края уплотнения с помощью шариковой ручки. Наконец, с помощью мягкой линейки измерьте диаметр уплотнения и отметьте результаты в миллиметрах.
Через семь дней пришло время вызвать всасывающий волдырь. Для индукции всасывания кожи волдыря используйте вакуумный насос с присоединенной всасывающей камерой. Используйте либо имеющееся в продаже, либо индивидуальное устройство.
Важно отметить, что насос должен регулироваться в диапазоне от минус 20 до минус 40 килопаскаль и обеспечивать стабильное и надежное отрицательное давление. Нижняя часть всасывающей камеры состоит из пластины с небольшим отверстием, которое соприкасается с кожей. Пластины могут иметь одно или несколько отверстий, и могут быть применены различные размеры, чтобы соответствовать кожной реакции.
Верхняя часть камеры должна позволять визуальный контроль за волдырем. Перед индукцией продезинфицируйте кожу и камерную пластину. Убедитесь, что рука удобно лежит в положении.
Прикрепите и закрепите камеру, здесь с помощью регулируемых ремней. Центр кожной реакции должен быть виден через отверстие в нижней пластине. Включите всасывающее устройство и отрегулируйте отрицательное давление до минус 20 килопаскаль.
Через тридцать минут увеличьте давление до минус 25 килопаскаль. Через 60 минут еще больше увеличьте давление до минус 30 килопаскалей. И держите здесь давление до тех пор, пока полностью не сформируется один волдырь.
Фаза индукции пузырей обычно занимает от одного до трех часов. При этом фактическое образование пузырей происходит постепенно в течение последних 30 минут, как показано здесь с высокой скоростью. Если есть признаки разрыва волдыря или кровоизлияния, рекомендуется медленно ослаблять давление и как можно раньше прекратить индукцию.
Волдыри могут выглядеть как одиночные или множественные сливающиеся волдыри. Этот процесс часто связан с ощущением зуда. После того как волдырь полностью сформируется, сбросьте давление и осторожно снимите всасывающую камеру.
При правильно индуцированных волдырях эпидермальный слой полностью отделяется от дермального слоя кожи, оставляя полость, заполненную жидкостью. Защитите волдырь, наложив мягкую повязку на окружающий участок кожи и наложив на него жесткий колпачок, в данном случае из пластиковой трубки объемом 15 миллилитров. Закрепите колпачок неаллергенной лентой, а затем мягкой, эластичной повязкой.
Проинструктируйте волонтера оставить защитную повязку на ночь. На следующий день аккуратно снимите повязку и продезинфицируйте область волдырей с помощью пульверизатора. Используйте стерильный шприц объемом 2 миллилитра с иглой 23 калибра для сбора содержимого волдыря.
Введите иглу в верхнюю боковую сторону крыши блистера и медленно всасывайте жидкость. Не прикасайтесь к дну полости, но обязательно соберите всю жидкость, так как объем волдырей может быть низким, как в этом примере. Свернувшийся волдырь заживет без рубцов.
Нанесите защитную повязку поверх блистера. Затем переложите жидкость из пузыря в стерильную трубку. Вращайте в течение четырех минут при 600 G с помощью настольной центрифуги.
После этого соберите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах клеточной среды. Теперь свежие клетки готовы к подсчету и дальнейшему анализу. Всасывающие блистерные клетки могут быть использованы для анализа in vitro, например, для проточной цитометрии.
В этом эксперименте с добровольцами, вакцинированными БЦЖ, выход клеток варьировался от 15 000 до более чем 200 000 клеток на волдырь. Здесь мы выделили клетки из одиночного всасывающего блистера и стимулировали клетки PPD in vitro с последующим окрашиванием и проточной цитометрией. Для сравнения мы провели параллельный анализ PBMC у того же добровольца, вакцинированного PCG.
На панелях вы видите популяции CD4-положительных Т-клеток, окрашенных для межклеточной продукции TNF-альфа, интерферона-гамма и IL2. У этого добровольца более 30% CD4-положительных Т-клеток, выделенных из кожи, были антиген-специфичными. Кроме того, индивидуальные цитокиновые профили блистерных клеток были репрезентативными как для центральных Т-клеток памяти, так и для эффекторных Т-клеток, иллюстрируя, как этот метод позволяет нам изучать долгоживущие реакции памяти, генерируемые in vivo.
На рисунке А показано, что жидкость, полученная из всасывающих блистеров, может быть проанализирована на цитокины, продуцируемые in vivo. На рисунке В мы культивировали клетки, полученные из всасывающих волдырей в течение четырех дней в присутствии микобактерий туберкулеза, иллюстрируя, как всасывающие пузырчатые клетки способны продуцировать интерферон-гамма и ФНО альфа ex vivo. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать и собирать клетки из всасывающих волдырей после отложения кожных антигенов.
В этой демонстрации мы использовали антиген, имеющий особое значение в области исследований туберкулеза. Но основные принципы этой методологии могут быть полезны в области адаптивного иммунитета или в исследованиях по изучению агентов, нацеленных на Т-клетки. Кроме того, помните, что этика и безопасность являются главным приоритетом при работе с людьми-волонтерами.
Также помните, что работа с человеческими образцами может быть опасной, и что в лаборатории всегда следует соблюдать меры предосторожности.
Обзор
В данном видео демонстрируется метод вызывания кожной вакуумной пузырянки, который позволяет осуществлять сбор антигенспецифических T-клеток и цитокинов in vivo. Этот метод особенно полезен для изучения адаптивного иммунного ответа человека, например, при разработке вакцин.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Адаптивный иммунный ответ
- Разработка вакцин
Теоретические основы
- Метод вакуумной блистерной пробы обеспечивает неинвазивный способ изучения иммунных ответов.
- Он позволяет осуществлять сбор T-клеток непосредственно из места иммунной реакции.
- PPD используется в качестве антигена памяти для оценки иммунной памяти.
- Данный метод может помочь в понимании клеточных механизмов иммунитета.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод вакуумного создания пузырей для сбора иммунных клеток.
- Проанализировать антигенспецифические Т-клеточные ответы у человека.
- Предоставить практическое руководство по внедрению данного метода в исследования.
Используемые методы
- Инъекция PPD в дермальный слой кожи.
- Индукция вакуумных пузырей для сбора Т-клеток и цитокинов.
- Измерение кожных реакций после инъекции.
- Сбор жидкости из пузырей для дальнейшего анализа.
Основные результаты
- Продемонстрирована успешная индукция вакуумных пузырей.
- Собранные Т-клетки и цитокины могут быть проанализированы in vitro.
- Установлена четкая методология измерения иммунных ответов.
- Доказаны безопасность и эффективность метода создания вакуумных пузырей.
Выводы
- Метод вакуумных пузырей эффективен для изучения адаптивного иммунитета.
- Данный метод может быть полезен при исследовании и разработке вакцин.
- Он представляет собой ценный инструмент для иммунологических исследований на людях.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководства
Изучение реакций памяти Т-клеток человека in vivo дает критически важные механистические сведения для разработки вакцин и валидации мишеней иммунотерапии. Метод кожного рецидива с использованием вакуумных пузырей обеспечивает прямой доступ к антигенспецифическим Т-клеткам и микроокружению цитокинов в месте иммунной реакции, что способствует снижению рисков при доклинических исследованиях агентов, нацеленных на Т-клетки. Этот подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, связывая результаты ex vivo с биологией человека in vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения антигенспецифических полифункциональных CD4+ T-клеток непосредственно из тканей человека.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной валидации мишеней T-клеток в системе, релевантной заболеванию.
- Стратегическая ценность: облегчает идентификацию перспективных соединений-лидеров, обеспечивая получение высокой фракции антигенспецифических клеток для механистического скрининга.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей стандартизации анализа с использованием мультиплексного и проточного цитометрического считывания.
- Операционная ценность: Получение количественных, воспроизводимых результатов продукции цитокинов и функциональности Т-клеток ex vivo.
- Стратегическая ценность: Обеспечение возможности масштабируемого повторного использования платформы для оценки влияния соединений на ответы Т-клеток памяти человека.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует релевантность заболеванию с помощью модели туберкулиновой реколл-реакции у людей, вакцинированных БЦЖ, что соответствует стратегиям поиска трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет анализа профилей центральной и эффекторной Т-клеток памяти, сформированных in vivo.
- Стратегическая ценность: Поддерживает принятие обоснованных решений по дальнейшему продвижению исследований с учетом рисков за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях клеточного иммунитета.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс исследований: от проверки гипотез на ранних стадиях открытия до идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации, что особенно актуально для разработки вакцин и терапии, модулирующей функции Т-клеток.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем сбора клонально экспансированных дифференцированных Т-клеток непосредственно из места иммунной реакции.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к анализу благодаря стандартизированным протоколам индукции This-бластеров и сбора жидкости, что позволяет поддерживать стабильную жизнеспособность клеток для последующего анализа.
- Аналитика: Позволяет проводить количественную оценку частоты антигенспецифических Т-клеток и полифункциональных цитокиновых профилей (например, IFN-γ, TNF-α, IL-2) для сравнительного анализа различных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, демонстрируя, каким образом клетки, полученные из вакуумных пузырей, отражают долговременный иммунный ответ памяти, сформированный in vivo.
- Корпоративное использование: Создает воспроизводимую базу для изучения адаптивного иммунитета человека в рамках программ по разработке вакцин и методов иммунотерапии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности в иммунных ответах человека.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость выделения антигенспецифических T-клеток из кожи человека.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях разработки иммунотерапии.
- Влияние на портфель: Приоритезация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе данных об иммунном ответе, релевантных для человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения исследований с участием добровольцев-людей, методы чрескожной доставки антигенов и методы индукции вакуумных стертостей.
- Необходимы регулируемый вакуумный насос (–20 по –40 kPa), стерильные шприцы, антиген PPD и центрифугирующее оборудование для обработки клеток.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов измерения стертостей, сбора материала и переноса жидкости между иммунологическими и клиническими группами.
- Предусматриваются особенности адаптации для различных моделей антигенов и участков кожной реакции при сохранении постоянных градиентов отрицательного давления.
- Включает практические ограничения, такие как вариабельный выход клеток (15 000–200 000 клеток/стертость) и зависимость от имеющейся иммунологической памяти добровольцев.
