Модель человека печени химерных мыши семейной гиперхолестеринемией, с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов
15 сентября 2018 г.
Здесь мы представляем протокол для создания человеческой печени химерных мыши модели семейной гиперхолестеринемией, используя человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов. Это является полезной моделью для тестирования новых терапий для гиперхолестеринемии.
Этот метод ответил на ключевые вопросы в этой области, такие как, как генерировать человека печени химерик модели мыши, семейная гиперхолестеринемия. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить тесты на наркотики in vivo. Этот метод имеет синдикации для лечения семейной гиперхолестеринемии.
В качестве новой терапии этого заболевания, он может быть протестирован с помощью таких химерных моделей животных. Хотя этот метод может обеспечить понимание семейной гиперхолестеринемии, он также может быть применен к другим наследственным заболеваниям печени. За 24 часа до engraftment, оттепель 40 микролитров внеклеточной матрицы на мышь, поместив в холодильник, в холодной комнате.
Охладите инсулиновый шприц для каждой мыши, которая будет введена и коробку 200 микролитров советы в четыре градуса по Цельсию холодильник. За час до engraftment, тепло фермента диссоциации клеток, дополненный 50 микрограммов на миллилитр DNAase 1, к комнатной температуре и место RPMI 1640 среды, дополненный 20 процентов замены сыворотки на льду. Возьмите фазы контрастные изображения iHeps для записи их статуса, в том числе морфологии клеток, роста и плотности клеток.
Далее, мыть каждый колодец iHeps с 2 миллилитров комнатной температуры кальция и магния ион-бесплатно PBS в два раза, а затем добавить один миллилитр предварительно разогретого фермента диссоциации клеток к каждому хорошо. Верните клетки в инкубатор на 8-10 минут. Мониторинг морфологии клеток под микроскопом.
Когда большинство клеток становятся круглыми, добавить в равном объеме холодной среды на колодец, пипетки клетки осторожно отделить от пластины, и передать клеточной подвески в новую трубку 15 миллилитров. Этот шаг имеет решающее значение для надежности гепатоцитов. Если клетки трудно отделить от пластины, некоторые из них могут быть оставлены на пластине.
А если клетки отсоединяются, то пипетка аккуратно после центрифугации, чтобы получить одноклеточную подвеску. Повторите процедуру отслоения клеток для каждой хорошо, пока почти все прилагаемые клетки не будут собраны. Затем центрифуга при 200 г в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию.
После центрифугации удалите супернатант и повторно приостановив клетки двумя миллилитров холодного PBS в пятнадцати миллилитровой трубке. Пипетт клетки мягко, чтобы получить одноклеточную подвеску. Затем перейдите клетки через 40 микрон-клеточный ситечко для удаления агрегатов.
Как правило, от одного до двух миллионов клеток о могут быть собраны после нескольких тер-ING. Далее добавьте микролитеры 0,4 процента trypan синий раствор 20 микролитров клеточной подвески. Подсчитайте клетки и замечите концентрацию клеточной подвески как C.Calculate необходимый объем клеточной подвески, чтобы ввести один миллион клеток на мышь.
Затем выделите необходимый объем клеточной суспензии на 15 миллилитровых трубок и центрифуг при 200 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта, повторно приостановить клетки в 27,5 микролитров холодного PBS на мышь. А затем добавить равный объем внеклеточной матрицы для конечного объема 55 микролитров на мышь.
Теперь поместите один из холодных инсулиновых шприцев на лед. Отключите поршень, перенесите 55 микролитров клеточной подвески в шприц, а затем положите поршень обратно. Разгрузить пузырьки осторожно, и положить шприц обратно на лед.
Убедитесь, что мышей LRG должным образом анестезировали перед началом процедуры инъекции. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры анестезии. После того, как мышь потеряла мышечный рефлекс для стимуляции, поместите его в правильном, боковом, decubitus позиции.
Нанесите толстый слой депиляативного крема на область разреза на левом фланге и оставьте на пять-восемь минут. Удалите крем для депиляния и волосы, вытирая область с увлажненной водой марлевой площадкой. Скраб левый фланг с 70 процентов этанола в три раза.
Затем найдите селезенку, которую можно увидеть на левом фланге. Затем окончательное замачивания с бетадином для дезинфекции. После использования ножниц, чтобы сделать 0,5 до одного сантиметра разрез в коже и брюшной стенке, использовать миппы для экстерьеризации селезенки, осторожно потянув окружающих жировой ткани.
Аккуратно стабилизировать селезенку с помощью тампона. Вставьте иглу инсулинового шприца три-четыре миллиметра в паренхиму селезенки и аккуратно ввишите около 50 микролитров клеточной суспензии. Убирать иглу и поместить ватный тампон над инъекцией в течение одной минуты, чтобы предотвратить кровотечение и утечку материала.
Верните селезенку в брюшовую, и закройте рану пятиох нейлоновыми швами. После за шва поместите мышь в чистую клетку с легким доступом к пище и воде. Начните с удаления внутренних органов из свежеухватанной мыши так, чтобы была видна нисходящая аорта, параллельная позвоночнику.
Затем вскрыть соседние ткани, и удалить сердце. Используйте тонкие ножницы, чтобы вскрыть аорты, поместив каждый из них в холодный, кислородом Krebs раствор. После сбора перенесите аорты в раствор кребса в силиконовую чашку Петри.
Прикрепите соединительной ткани, чтобы исправить положение аорты, не растягивая его. Под стерильным микроскопом используйте тонкие типсы и пружинные ножницы, чтобы вскрыть аорту, свободную от окружающего жира и приключенческой ткани, не повреждая стенку сосуда. Затем разрежьте каждую аорту на сегменты длиной от полутора до двух миллиметров.
Затем вырежьте двухметровый кусок 40 микрон толщиной нержавеющей проволоки, и аккуратно вставьте в люмен аорты. Держите провод для переноса сегмента в проволочную миографическую камеру, наполненную кислородным раствором Кребса. Чтобы измерить длину сегментов аорты при изучении контрактности, поместите каждый сегмент перпендикулярно между челюстями и запикаете показания D1 на микрометре.
Затем удалите сегмент и переместить челюсти вместе. Запись чтения D0 и рассчитать длину сегмента. Затем зажим провода и закрепте его отверткой, поместив неимовеченный сегмент между челюстями.
Для нормализации перед экспериментом установите миограф до нуля в непротянутом положении. Затем медленно перемещать челюсти друг от друга и наблюдать аорты изменения напряжения до достижения трех millinewton. Через 15 минут вылейте раствор из миографической камеры и замените свежим раствором Кребса.
Прожгев еще 15 минут, снова отрегулируйте напряжение до трех миллиньютонов. Затем измените стандартный раствор Кребса на раствор Кребса, дополненный хлоридом калия 60 миллимолярия, чтобы вызвать сокращение в течение не менее пятнадцати минут. Промыть свежим раствором Кребса три раза, затем добавить увеличение концентрации фенилэфрина.
Например, от 10 наномолярных до 100 микромолеров. Затем, после промывания стандартным раствором Кребса, добавьте одну концентрацию фенилэфрина, около 70 процентов максимального сокращения. Когда сокращение является стабильным, добавить увеличение концентрации ацетилхолина с двухминутными интервалами.
Например, от одного до трех наномолярных до десяти до тридцати микромолеров, чтобы вызвать вазодилатации. На этом снимке показано репрезентативное цельное сканирование изображения окрашивания человеческого альбумин в печени мыши, заселенной липопротеиновыми рецепторами низкой плотности. Стрелки указывают на скопления человеческих iHeps, присвятанные в печень мыши.
Кластеры engrafted человека iHeps видны более подробно здесь. На этом графике рассеяния показан процент заселенных человеческих альбуминовых положительных клеток, соответствующих iHep, содержащим участки в печени мыши, от различных донорских iPSCs. Это репрезентативное изображение иммуногистохимического окрашивания для ядер человека в печени мыши, с приписки семейной гиперхолестеринемии iHeps.
График бара показывает процент заселенных человеческих ядер положительные iHeps от различных донорских iPSCs в печени мыши LRG. Это репрезентативные изображения человеческого альбумин и человеческих ядер окрашивания на двух последовательных участках печени мыши, заселенных диким типом iHeps. Наконец, это изображение показывает эндотелий-зависимых вазодилатации аорты в семейной гиперхолестеринемии печени человека химерных мышей, в ответ на увеличение концентрации ацетилхолина.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать человека печени химерных мышей, используя человека iPSC полученных гепатоцитов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол создания химерной модели мыши с человеческой печенью для изучения семейной гиперхолестеринемии с использованием гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Эта модель имеет важное значение для тестирования новых методов терапии, направленных на лечение гиперхолестеринемии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Генетика
Теоретические основы
- Семейная гиперхолестеринемия представляет собой генетическое нарушение, влияющее на метаболизм холестерина.
- Химерные модели мышей служат платформой для тестирования лекарственных препаратов in vivo.
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека могут быть дифференцированы в гепатоциты.
- Данный подход может быть применен и к другим наследственным заболеваниям печени.
Цель исследования
- Разработка надежной модели для изучения семейной гиперхолестеринемии.
- Облегчение тестирования новых терапевтических стратегий.
- Получение данных о механизмах наследственных заболеваний печени.
Используемые методы
- Создание химерных моделей мышей с человеческой печенью.
- Использование гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.
- Тестирование лекарственных препаратов in vivo.
- Подготовка внеклеточного матрикса для трансплантации.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно создавать химерные модели мышей.
- Для оценки эффективности новых методов терапии могут быть проведены тестирования лекарственных препаратов.
- Эта модель дает ценную информацию о семейной гиперхолестеринемии.
- Отмечены возможности применения данного метода при других наследственных заболеваниях печени.
Выводы
- Данный метод представляет собой значительный шаг вперед в моделировании семейной гиперхолестеринемии.
- Он открывает возможности для тестирования новых методов лечения в соответствующем биологическом контексте.
- Будущие исследования могут расширить область его применения на другие заболевания печени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данная модель химерной мыши с печенью человека восполняет критический пробел в доклинических исследованиях лекарственных препаратов для лечения семейной гиперхолестеринемии, предоставляя релевантную человеку систему для оценки гиполипидемической терапии. Она позволяет снизить механистические риски при разработке новых методов лечения, таких как антитела к PCSK9, демонстрируя их дифференциальную эффективность по сравнению со статинами в контексте соответствующего заболевания. Модель способствует валидации мишеней и согласованию трансляционных биомаркеров для наследственных заболеваний печени, повышая прогностическую достоверность решений на ранних этапах поиска новых препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию гепатоцитов с дефицитом LDLR in vivo для подтверждения терапевтических мишеней при семейной гиперхолестеринемии.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимую систему для оценки взаимодействия с мишенью и модуляции сигнальных путей новыми гиполипидемическими препаратами.
- Стратегическая ценность: способствует проверке гипотез и снижению биологических рисков перед переходом к этапу оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать валидированные популяции гепатоцитов человека, реагирующие на фармакологические воздействия, для использования в анализах.
- Практическая ценность: создает стандартизированную платформу химерной печени с количественно определяемой приживаемостью (5-10%) для обеспечения воспроизводимых измерений ответа на лекарственные препараты.
- Стратегическая ценность: способствует скринингу терапевтических кандидатов в микросреде печени человека для повышения прогностической значимости трансляционных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Воспроизводит клинические наблюдения о более высокой эффективности антител к PCSK9 по сравнению со статинами в системах с дефицитом LDLR.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдного мониторинга приживления человеческого альбумина и ядер для оценки стабильности модели и ответа на лекарственную терапию.
- Стратегическая ценность: Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении препарата с учетом рисков, предоставляя доклинические доказательства терапевтического превосходства в релевантной модели заболевания.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данная модель интегрирована в общий процесс разработки — от валидации мишени до доклинической оценки, что обеспечивает плавный переход от изучения механизмов заболевания к терапевтическим испытаниям при наследственных заболеваниях печени.
- Открывающая биология: обеспечивает функциональную валидацию путей LDLR и PCSK9 в контексте химерной печени человека для уточнения механизмов заболевания.
- Скрининг: предоставляет количественные показатели приживаемости и ответа на препараты, что позволяет сравнивать терапевтических кандидатов в различных условиях.
- Аналитика: обеспечивает измеримые результаты, включая площадь экспрессии человеческого альбумина и процент приживаемости ядер, для оценки эффективности химеризации и фармакологической модуляции.
- Трансляционные исследования: связывают результаты первичных открытий с доклинической валидацией путем моделирования специфичного для человека липидного обмена и терапевтического ответа.
- Корпоративное использование: создает адаптируемую платформу химерной печени, применимую к множеству наследственных заболеваний печени, помимо семейной гиперхолестеринемии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет сокращения видоспецифичных расхождений в липидном обмене.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам подготовки гепатоцитов, приживления и окрашивания.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем демонстрации дифференциальной эффективности препаратов на релевантной для человека доклинической модели.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию гиполипидемической терапии с учетом рисков на основе данных о механизмах действия и эффективности, полученных на химерных моделях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в дифференцировке иПСК, культивировании гепатоцитов и методах хирургического приживления.
- Успешное заселение человеческими клетками зависит от использования иммунодефицитных линий мышей LRG и подготовки внеклеточного матрикса.
- Необходимы стандартизированные межгрупповые протоколы количественного определения клеток, оценки их жизнеспособности и мониторинга приживления.
- При применении модели для других наследственных заболеваний печени с различным генетическим фоном требуются соответствующие адаптационные меры.
- Ограничено частичным заселением печени (5-10%), что может повлиять на масштабирование метаболических показателей при высокопроизводительном анализе.
