Дрозофилы In Vivo травмы модель для изучения Neuroregeneration в периферической и центральной нервной системы

Общая цель этой модели повреждения сенсорных нейронов личинок дрозофилы состоит в том, чтобы объединить живую визуализацию in vivo, двухфотонную лазерную аксотомию/дендриотомию и мощный генетический инструментарий мухи в платформу для скрининга потенциальных промоторов и ингибиторов нейрорегенерации. Этот метод поможет решить ключевые вопросы в области нейрогенерации, например, путем выявления новых внутренних и внешних регуляторов нейрогенерации, как в периферической, так и в центральной нервной системе. Основное преимущество этого метода заключается в том, что новые кандидаты на нейрорегенерацию могут быть обследованы простым, быстрым и дешевым способом.

Хотя эта система может дать представление о нейрорегенерации, она также может быть применена к другим системам, таким как нейродегенеративные заболевания и взаимодействия нейронов и глии. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что различные экспериментальные установки, использующие разные типы нейронов, используются для моделирования регенерации аксонов и дендритов. Для сбора личинок готовят бутылочки с культурой следующим образом.

С помощью лезвия проделайте 1,5-сантиметровое отверстие в одной из стенок бутылки с культурой дрозофилы, и заполните отверстие ватным тампоном для вентиляции. Затем нанесите каплю дрожжевой пасты на агаровую пластину с виноградным соком и используйте пластину, чтобы заглушить основное отверстие бутылки. В такой бутылке установите крест из 10 девственных самок и пяти самцов и ежедневно меняйте тарелку, выращивая при температуре 25 градусов по Цельсию.

Культурируйте собранные планшеты влажной тканью, смоченной в слабой пропионовой кислоте, чтобы предотвратить загрязнение. Из культивируемых пластин собирают личинок на необходимом этапе с помощью щипцов. Аккуратно переложите собранные личинки на новую агаровую пластину из виноградного сока без дрожжевой пасты.

После того, как они очистятся, ползая, их можно визуализировать. Чтобы начать каждый сеанс визуализации, включайте лазеры для визуализации и микроскоп. При травме используют двухфотонный микроскоп.

В программном обеспечении для обработки изображений настройте лазер на просмотр GFP на 930 нанометрах с максимальной мощностью 1950 милливатт. Выберите «Режим сканирования линии» и полностью откройте отверстие. Затем увеличьте интенсивность лазера примерно до 20% от полной мощности, чтобы вызвать травму ПНС, или до 50-100% от полной мощности, чтобы вызвать травму ВНК.

Затем выберите кадр 512 квадратных пикселей для сканирования и используйте максимально возможную скорость сканирования. Используйте среднее число одного и битовую глубину восемь бит. Затем установите усиление примерно на 750, а смещение установите на ноль.

Теперь сохраните этот предустановленный экспериментальный протокол как абляция 2P GFP 930, что позволяет легко использовать его в дальнейших экспериментах. Для визуализации после травмы используйте конфокальный микроскоп. Сначала настроили аргоновый лазер на 488 нанометров.

Перейдите на вкладку Acquisition (Приобретение), а затем выберите Z Stack (Стек Z). В разделе Лазер включите аргоновый лазер с яркостью 488 нанометров. Затем перейдите в раздел «Каналы», выберите лазер с яркостью 488 нанометров и увеличьте мощность лазера до пяти-10%.

Затем отрегулируйте усиление на 650. Теперь в режиме съемки выберите 1024 квадратных пикселя в качестве сканирования кадра. Используйте максимальную скорость сканирования.

Используйте среднее число два и битовую глубину восемь бит. Сохраните этот предэкспериментальный протокол как GFP Imaging. Начните с обезболивания личинок.

В вытяжном шкафу поместите 60-миллиметровую стеклянную тарелку в 15-сантиметровую пластиковую чашку Петри. Затем сложите лист папиросной бумаги и положите его в стеклянную посуду. Поместите пластину с виноградным агаром на ткань, после того как будет добавлен диэтиловый эфир.

Затем на предметное стекло нанесите одну каплю масла Halocarbon 27 в центр и нанесите по пятну вакуумной смазки на каждый из четырех углов. Затем с помощью щипцов перенесите одну личинку на агаровую пластину и накройте стеклянную посуду для обезболивания личинки. Как только личинка перестанет двигаться, осторожно переложите ее в галогуглеродное масло, с вертикально поднятой головой.

Затем наденьте на предметное стекло защитный листок и осторожно нажмите на него, пока он не коснется личинки. Затем с мягкой силой сдвиньте защитное стекло, чтобы свернуть ячейки, которые будут удалены, туда, где двухфотонный лазер будет наиболее легко их поразить. Местоположение будет варьироваться в зависимости от того, на какие нейроны нацелены.

Теперь закрепите сборку на предметном столике двухфотонного микроскопа и сфокусируйтесь на интересующих вас клетках с помощью объектива с 40-кратным масляным погружением. В программном обеспечении переключитесь в режим сканирования и загрузите сохраненный протокол. Убедитесь, что отверстие открыто до упора.

Затем в режиме Live Mode получите хорошее изображение интересующей области. Затем остановите сканирование в реальном времени, чтобы кнопка «Обрезать» стала доступна. С помощью функции «Обрезка» отрегулируйте окно сканирования так, чтобы сфокусировать целевую область только на предполагаемом месте травмы.

Затем откройте новое окно изображения. Теперь уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Затем переключите кнопку Непрерывный, чтобы начать и остановить сканирование.

Смотрите внимательно. Как только произойдет резкое увеличение цветения, завершите сканирование. Затем переключитесь обратно в исходное окно изображения и выберите режим Live Mode, а затем найдите область, на которую только что нацелились, настроив фокус.

Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевидной структуры или локализованных обломков прямо на месте травмы. Если мощность лазера была слишком высокой, будет виден большой поврежденный участок, который может привести к летальному исходу. Теперь аккуратно снимите крышку и переложите раненую личинку на новую пластину с дрожжевой пастой.

Выложите тарелку в 60-миллиметровую посуду, вместе с которой пропионовой кислотой пропитайте ткань. Затем верните пластину к температуре культивирования. Для последующей визуализации личинки используйте сохраненную конфокальную установку и соберите изображения стека Z с объективом 25X.

Обязательно укажите точку нормализации, чтобы можно было количественно оценить регенерацию. С использованием описанного протокола была исследована регенерация нейронов DA третьего и четвертого классов. Как правило, были повреждены три или четыре нейрона на правой стороне брюшных сегментов от А7 до А2.

В частности, были нацелены на нейроны DDAF третьего класса и четвертого класса V Prime. Личинки были сфотографированы через 24, 48 и 72 часа после травмы. Через 24 часа дистальные аксоны обычно завершали дегенерацию, и стебель аксона был хорошо виден.

Через 48 часов удалось оценить регенерацию в нейронах DA четвертого класса. Около 70% этих нейронов регенерировали за пределами места повреждения. Однако даже через 72 часа стало ясно, что нейроны DA третьего класса не смогли восстановиться.

Это было оценено на основе неоднократных наблюдений за остановившимися конушками роста. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как организовать эксперимент, выполнить двухфотонное повреждение и оценить результаты. После освоения эта техника занимает 15 минут на личинку, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о сравнении экспериментального роста с соответствующими контрольными группами бок о спину. После этой процедуры может быть выполнен такой метод, как иммуноокрашивание, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, может ли повреждение аксона вызвать транслокацию белка, приводящую к изменению пути. С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейронауки к изучению нейрорегенерации сенсорных нейронов личинок дрозофилы.

Наконец, не забывайте, что работа с диэтиловым эфиром может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как проведение личиночной анестезии в вытяжном шкафу.