Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать три компартмента корневого микробиома: почву, ризосферу и корневую эндосферу, используя профилирование гена 16S рибосомальной РНК в сообществе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы экологии микроорганизмов, такие как биотические и абиотические факторы, которые являются важными факторами структуры микробиома. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она стандартизирует каждый этап, от разделения корня и ризосферы до извлечения ДНК и подготовки библиотеки секвенирования.

Демонстрировать эту процедуру будет Тьюздей Симмонс, аспирант лаборатории Коулмана-Дерра. Чтобы начать составление протокола, соберите объемные образцы почвы с помощью стерилизованного этанолом кернового коллектора, чтобы получить почву, свободную от корней растений. Соберите сердцевину примерно в 23-30 сантиметрах от основания растения.

Затем переложите почву в полиэтиленовый пакет, гомогенизируйте почву, осторожно встряхивая пакет, переложите 600-миллиграммовую аликвоту образца почвы в одну двухмиллилитровую пробирку и сразу же поместите двухмиллилитровую пробирку на сухой лед до извлечения ДНК. Чтобы собрать корень и ризосферу, используйте стерилизованную этанолом лопату, чтобы выкопать растение, стараясь получить как можно больше корня. Аккуратно стряхните лишнюю почву с корней до тех пор, пока к поверхности корня не прилипнет примерно два миллиметра почвы.

Для крупных растений используйте стерильные ножницы, чтобы вырезать репрезентативный участок корней, и поместите минимум 500 миллиграммов корневой ткани в 50-миллилитровый конический флакон. Добавьте достаточный буфер для удаления эпифитов, чтобы покрыть корни, затем сразу же поместите образец на сухой лед. Чтобы отделить ризосферу от корней, разморозьте образец корня на льду, затем обработайте образцы корней ультразвуком.

Переложите корни в охлажденную, чистую 50-миллилитровую трубку с помощью стерильных щипцов. Не выбрасывайте оригинальную трубку с буфером и грунтом. В нем содержится ризосферная дробь.

Затем центрифугируйте пробирку, содержащую буфер и ризосферу. Сцедите надосадочную жидкость, а фракцию ризосферы поместите в сухой лед. Чтобы промыть корни, добавьте к корневой фракции примерно 20 миллилитров стерильной воды четырех градусов Цельсия.

Промойте корень, энергично встряхивая в течение 15-30 секунд, затем слейте воду. С помощью стерильного шпателя быстро перенесите 250 миллиграммов почвы и ризосферы в отдельные пробирки для сбора, входящие в состав коммерческого набора для выделения ДНК для экстракции почвы, затем действуйте в соответствии с протоколом поставщика набора. После элюирования храните ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не сможете приступить к подготовке библиотеки ампликонов, затем извлеките ДНК из образцов корня.

Стерилизованную ступку охладить и смочить пестиком, используя жидкий азот. Отмерьте от 600 до 700 миллиграммов корневой ткани, поместите ткань в раствор и осторожно добавьте достаточное количество жидкого азота, чтобы покрыть корни. Измельчите корни на небольшие кусочки.

Продолжайте процесс добавления жидкого азота и измельчения не менее двух раз, соблюдая согласованность между образцами, пока корни не превратятся в мелкий порошок. Быстро, пока порошок корня не начал оттаивать, с помощью стерильного шпателя переложите порошок корня в заранее взвешенные 1,5-миллилитровые трубочки со льдом. Запишите вес тюбика и порошка.

С помощью стерильного шпателя быстро перенесите 150 мг порошка корня в пробирку для сбора, предусмотренную в коммерческом наборе для выделения ДНК, предназначенном для извлечения из почвы, затем приступайте к выделению ДНК в соответствии с протоколом поставщика набора. Приготовьте достаточное количество мастер-смеси для ПЦР для амплификации каждого образца ДНК в трех экземплярах. Налейте мастер-смесь в стерильный 25-миллилитровый многоканальный резервуар для пипетки и распределите 66 микролитров мастер-смеси в каждую лунку нового 96-луночного ПЦР-планшета.

Затем добавьте шесть микролитров по пять нанограммов на микролитр ДНК с нормализованной ДНК-пластины на основную пластину для смешивания. Затем добавьте на мастер-пластину 1,5 микролитра 10 микромолярного прямого праймера, так, чтобы каждый столбец имел свой прямой штрих-код, и 1,5 микролитра 10 микромолярного обратного праймера, так что каждая строка имеет свой обратный штрих-код. Накройте тарелку пленкой и кратковременно опустите тарелку при 3 000 RCF.

С помощью многоканальной пипетки аккуратно перемешайте содержимое, затем разделите их на три пластины с 25 микролитрами реакционной смеси и накройте пластины пленкой ПЦР. Амплифицируйте ДНК в каждой пластине с помощью термоамплификатора. После амплификации объедините три повторяющихся планшета в одну 96-луночную пластину.

С помощью компьютерной таблицы рассчитайте объем в 100 нанограмм каждого образца, а также средний объем для всех образцов. Для каждого бланка ПЦР-продукта добавьте рассчитанный средний объем в одну 1,5-миллилитровую пробирку. Для успешно амплифицированных образцов сгруппируйте 100 нанограммов каждого образца в одну и ту же пробирку, затем измерьте концентрацию объединенного продукта с помощью настольного флуориметра и выведите 600 нанограммов ДНК в молекулярной воде до конечного объема 100 микролитров в 1,5-миллилитровой пробирке.

Храните оставшийся продукт при температуре минус 20 градусов Цельсия. Перед очисткой 600-нанограммовой аликвоты ДНК приготовьте 600 микролитров свежего 70% этанола. Следите за установленным процессом очистки ПЦР с помощью парамагнитных шариков.

Встряхните трубку с магнитными шариками, чтобы снова подвесить шарики, которые оседают на дно. Добавьте 1 объем, 100 микролитров, раствора гранул к 600-нанограммовой аликвоте ДНК. Тщательно перемешайте раствор и шарики пипетированием 10 раз.

После тщательного перемешивания выдержать смесь в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите трубку на магнитную подставку на две минуты или пока раствор не станет прозрачным, чтобы отделить шарики от раствора. Держите трубку в подставке, осторожно аспирируйте прозрачную надосадочную жидкость, не касаясь магнитных шариков, и выбросьте ее.

Оставьте пробирку на подставке, добавьте в пробирку 300 микролитров 70%-ного этанола и выдержите шарики при комнатной температуре в течение 30 секунд. Отсадите этанол и выбросьте его. Повторите этот процесс и удалите весь этанол после второй стирки.

Снимите тюбик с магнитной подставки и высушите содержимое на воздухе в течение пяти минут. Добавьте к высушенным шарикам 30 микролитров молекулярной воды и перемешайте пипеткой 10 раз. Выдерживать при комнатной температуре в течение двух минут.

Верните трубку на магнитную подставку на одну минуту, чтобы отделить шарики от раствора. Переложите элюат в новую трубку. Измерьте конечную концентрацию очищенной, объединенной ДНК с помощью настольного флуориметра.

Разбавьте аликвоту до 10 наномоляров в конечном объеме 30 микролитров или до концентрации и объема, предпочтительных для установки для секвенирования. После этапа амплификации было проведено секвенирование для определения состава бактериального сообщества каждого образца. Выравнивание последовательности ПНК по каждому гену хлоропласта и митохондриальной 16S рибосомальной РНК для исследуемого растения-хозяина не должно выявить каких-либо несоответствий.

Однократное несоответствие с последовательностью PNA из 13 пар оснований может резко снизить эффективность, как в случае предоставленной последовательности PNA хлоропласта и гена рибосомальной РНК хлоропласта 16S Lactuca sativa, или салата. Поскольку в каждом образце было объединено равное количество амплифицированной ДНК, после секвенирования было получено четное количество прочтений, которые соответствуют бактериальным таксонам, отсортированным на основе их индекса со штрих-кодом. После освоения этой техники ее можно проделать на восьми растениях примерно за восемь часов.

При попытке выполнить эту процедуру важно соблюдать последовательность между экспериментами. Мелкие детали, такие как изменения в методе экстракции ДНК и мастер-миксе ПЦР, могут привести к систематической ошибке. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как метатранскриптомика, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие микробы активны и какие гены они экспрессируют.

Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих СИЗ.