Тонкий фильм композитный кремния эластомеров для культуры клеток и приложений кожи: производство и характеристика

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении и определении характеристик полимерных тонкопленочных композитных структур для расширенных исследований клеточных культур или в качестве кожных клеев. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как эластомерные композиты могут быть использованы для достижения оптимального адгезионного действия даже на неровных поверхностях. Основные преимущества этих методик заключаются в том, что они просты и универсально применимы.

Это позволяет осуществлять крупносерийное производство с очень высокой точностью. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что измерения адгезии требуют интенсивной подготовки и практики для достижения необходимой точности. Процедуры культивирования клеток и применения плазмы будет демонстрировать Анжела Рутц, техник из нашей лаборатории.

Для приготовления PDMS смешайте и дегазируйте 1,1 грамма смеси преполимера в скоростном смесителе при 2350 об/мин под вакуумом в течение трех минут. Для подготовки подложного слоя PDMS используйте автоматически управляемую машину для нанесения ракельного лезвия. Поместите ракельное лезвие поверх очищенного от 100% изопропанола куска ПЭТ-фольги и с помощью винтов микропозиционирования отрегулируйте толщину подложки.

Загрузите PDMS в одноразовый шприц объемом 10 миллилитров. Заполните резервуар ракельного лезвия полимером, и начните движение лезвия со скоростью примерно 2 миллиметра в секунду. Когда кусок ПЭТ-пленки будет покрыт, перенесите пленку в духовку при температуре 95 градусов Цельсия на один час.

Чтобы подготовить верхний слой композитной пленки, с помощью лезвия удалите тонкие полоски с длинных сторон подложки. Чтобы ракельное лезвие можно было скользить по ПЭТ-пленке, нанесите второй слой PDMS, как описано выше. Затем поместите фольгу в духовку.

Чтобы подготовить образцы к измерению адгезии, с помощью лезвия бритвы разрежьте пленки на ПЭТ-фольге на четыре квадратных сантиметра и с помощью УФ-клея закрепите кусочки на предметном стекле. Осветите детали ультрафиолетовым светом в течение трех минут и установите первый полимерный образец на держатель образца. С помощью угломера отрегулируйте угол наклона до тех пор, пока подложка не соприкоснется с полимерной пленкой при полностью параллельном выравнивании обеих поверхностей, как это визуализировано на изображениях с камеры.

Оптическое выравнивание подложки по образцу имеет большое значение для интерпретации результатов измерений. Поэтому регулировку угла наклона нужно выполнять как можно точнее с помощью инклинометра. Переместите выровненную подложку на поверхность полимерной пленки до тех пор, пока не будет достигнуто напряжение предварительной нагрузки 13 плюс-минус пять килопаскалей, и запустите специально запрограммированный пакет программного обеспечения, написанный в LabView.

Затем установите необходимые параметры измерения для измерения адгезионных свойств трех независимых изготовленных образцов в шести различных местах на каждой поверхности пленки. Чтобы подготовить пленки для оптической микроскопии, с помощью лезвия бритвы разрежьте полимерный образец на кусочки площадью 0,25 квадратного сантиметра и прикрепите кусочки к краю предметного стекла. Затем поместите предметное стекло в вертикальной ориентации под вертикальный микроскоп и измерьте толщину поперечного сечения пленки.

Чтобы подготовиться к эксперименту с клеточными культурами, сначала используйте скальпель, чтобы вырезать кусочки примерно пять на пять миллиметров от поддерживающего слоя ПЭТ, и с помощью пинцета перенесите кусочки на отдельные 12-миллиметровые стеклянные покровные листы. Перенесите крышки внутрь реакционной камеры плазменной установки и закройте крышку устройства. Вакуумируйте камеру до тех пор, пока не будет достигнуто давление в 1,6 раза по 10 до минус второго миллибар, и обрабатывайте пленки плазмой в течение трех минут.

Затем проветриваем реакционную камеру и переносим образцы в отдельные лунки 24-луночного планшета. Затем промойте 70–80% конфлюентную культуру клеток L929 с DPBS, не содержащим кальция и магния, в течение 30 секунд в ламинарном шкафу. Затем следует пятиминутная инкубация с двумя миллилитрами соответствующего протеолитического и коллагенолитического раствора при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Когда клетки разъедутся, добавьте восемь миллилитров сыворотки, дополненной средой, и переложите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку. Затем, после подсчета, засейте 60 000 клеток на миллилитр среды в лунку 24-луночного планшета, содержащего полимерные образцы, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на три дня до захвата фазового контрастного изображения и фиксации. В зависимости от толщины верхней пленки наблюдается уменьшение напряжения отрыва с увеличением толщины пленки, независимо от текстуры поверхности подложки.

Однако работа разделения обычно немного ниже для шероховатых поверхностей основания по сравнению с гладкими. При регистрации механизма отслойки на самых тонких пленках наблюдается незначительная кавитация, в то время как на более толстых пленках наблюдается появление пальцевидных трещин. Эксперименты с клеточными культурами показывают, что клетки, посеянные на нетронутых полимерах, демонстрируют плохую способность к прикреплению и распространению клеток, в то время как сливающийся монослой наблюдается для клеток, культивируемых на обработанных плазмой поверхностях.

В целом, уровни лактатдегидрогиазы сопоставимы для клеток, культивируемых на обоих полимерных материалах, с цитотоксичностью менее 5%. После освоения производство полимерных пленочных композитов может быть завершено примерно за три часа. Несмотря на то, что последующий анализ с помощью обычного теста на липкость требует обучения, он является очень мощным инструментом для исследования адгезионных свойств пленок.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить тонкие полимерные композитные пленки и анализировать их с помощью специальных тестов на адгезию и клеточных биологических инструментов. Не забывайте, что работа с химическими и биологическими материалами может быть крайне опасной. Поэтому примите соответствующие меры предосторожности, такие как соблюдение обязательных процедур безопасности, ношение средств индивидуальной защиты и обращение с этими материалами в защитном шкафу.