Молекулярный анализ эндотелиальной мезенхимальных перехода, вызванных преобразования сигналов фактор роста β

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии сосудов и рака, такие как механизмы эндотелиальной пластичности при различных патологических состояниях, включая рак. Основное преимущество этой методики заключается в том, что надежная индукция in vitro EndMT достигается путем обработки эндотелиальными клетками TGF-in MS-1. Сначала выращивайте клетки MS-1 в стандартных условиях культивирования и избегайте слияния культуры.

Затем на 10-сантиметровой посуде промойте клетки MS-1 1x фосфатно-соевым буфером. Затем добавьте в тарелку 1 мл трипсина и инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте 9 мл питательных сред к трипсинизированным клеткам для отслойки.

Затем соберите суспензию трипсинизированных клеток в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при температуре от 300 до 400 x G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем используйте автоматический счетчик ячеек для подсчета количества жизнеспособных клеток.

Затем поместите клетки MS-1 на стандартные культуральные планшеты без покрытия для долгосрочного культивирования. Через 24 часа стимулируйте эндотелиальные клетки конечной концентрацией TGF-2 1 нг на миллилитр. Затем инкубируйте культуральную пластину при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

После 48 часов обработки замените среду свежей, предварительно подогретой питательной средой, содержащей TGF-2 Для последующего анализа поместите клетки MS-1 на предметное стекло 8-луночной камеры, предварительно покрытое желатином. Через 24 часа добавьте в культуру клеток 10 М ингибитора ROCK. Через час стимулируйте эндотелиальные клетки конечной концентрацией TGF-2 1 нг на миллилитр

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию. Для культуры в течение 72 часов замените старую среду свежей средой, содержащей TGF-2, через 48 часов. После целого дня TGF-обработки удалите среду.

Затем зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом и фосфатно-солевым буфером на 20 минут при комнатной температуре. По истечении периода закрепления промойте клетки фосфатно-солевым буфером. Затем инкубируйте клетки с 0,2% Triton X-100 в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут снова прополощите клетки 1x фосфатно-солевым буфером три раза. После трех промывок инкубируйте клетки с разведенным флуоресцентным фаллотоксином, содержащим блокирующий буфер, в течение часа при комнатной температуре. После инкубации промойте клетки 1x фосфатно-солевой буфером, трижды.

Затем окрашивайте ядра клеток с помощью красителя, связывающего нуклеиновую кислоту цианина, в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут промойте предметное стекло и закрепите на него защитное стекло с помощью монтажного материала. Наблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом.

При обработке TGF-2 в клетках наблюдается реорганизация толстых напряженных волокон. Это указывает на активность TGF-2 в индуцировании EndMT в эндотелиальных клетках. После 72 часов обработки TGF-2 откажитесь от среды и зафиксируйте клетки с помощью от 0,5 до 1 мл 50% холодного метанола и 50% ацетона на пять минут.

Затем промойте клетки 1x фосфатно-солевой буфером, трижды. После завершения трех промывок инкубируйте клетки с первичными антителами в блокирующем буфере на ночь при температуре 4 градуса Цельсия в темноте. На следующий день снова промойте клетки 1x фосфатно-солевым буфером, трижды.

Затем инкубируйте клетки с зеленым красителем, конъюгированным вторичным антителом к VE-кадгерину в блокирующем буфере, в течение одного часа в темноте. Снова промойте клетки 1x фосфатно-солевым буфером, трижды. Затем окрашивайте ядра клеток с помощью красителя, связывающего нуклеиновую кислоту цианина, в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут промойте предметное стекло и закрепите на него защитное стекло с помощью средства для крепления предметного стекла. Затем понаблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом. Клетки демонстрируют снижение экспрессии VE-кадгерина и повышенную экспрессию гладкомышечного актина при лечении TGF-2 в течение 48-72 часов.

Перед проведением анализа на сокращение коллагенового геля проводят культивирование клеток MS-1 в присутствии и отсутствии TGF-2 в течение 72 часов. Затем приготовьте коллагеновый гель 1 типа на льду. Затем смешайте 800 л раствора коллагенового геля с 200 мл контрольных или обработанных TGF-2 эндотелиальных клеток.

Далее добавьте по 1 мл этой смеси в каждую лунку 12-луночного планшета для культивирования. Дайте гелю застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут. После застывания геля добавьте 1 мл MEM Alpha, содержащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 единиц на миллилитр пенициллина и 50 г на миллилитр стрептомицина, чтобы гель всплыл.

Затем отделите гель от стенки лунки и инкубируйте плавающий гель при температуре 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. После 48 часов инкубации отсканируйте изображения геля с нижней части пластины с помощью сканера. Видны отчетливые морфологические изменения, трансформирующие клетки из булыжника в мезенхимальную веретенообразную архитектуру из-за воздействия TGF-2 в течение 72 часов.

Интересно, что лечение TGF beta 2 в течение 48-72 часов показывает увеличение как мРНК, так и уровня экспрессии белка гладкомышечного актина в клетках MS-1. Анализ на сокращение геля также показывает, что при лечении TGF-2 гель коллагена 1-го типа значительно сокращается. Интересно, что депривация TGF-2 снижает уровень гладкомышечного актина до базального уровня, и клетки восстанавливают морфологию булыжника, что указывает на то, что EndMT является динамическим процессом.

Фактически, ингибирование микроРНК 31 ингибитором микроРНК LNA с использованием клеток MS-1 ослабляет индукцию мезенхимальных маркеров. Тем не менее, ингибитор не влияет на индукцию генов-мишеней TGF, таких как фибронектин 1, PAI-1 и Smad 7. Следование этой процедуре в качестве метода, такого как экспрессия генов, нокдаун или модуляция микрочипа, может быть выполнено для ответа на дополнительные вопросы, такие как специфическая функция гена и микроРНК в EndMT.