Два метода для Decellularization растительных тканей для приложений, инженерия тканей
May 31st, 2018
Здесь мы представляем, и контраст двух протоколов используется для decellularize растительных тканей: подход на основе моющих средств и моющих средств свободный подход. Оба метода оставить позади внеклеточного матрикса в тканях растений используется, который затем может быть использован как строительные леса для ткани инженерных приложений.
Эти методы могут помочь в решении ключевых вопросов в области биоматериалов, таких как разработка каркаса с отличными возможностями переноса жидкости со сложными ультраструктурами и масштабируемым производством. Основное преимущество этих методик заключается в том, что их можно применять к большинству растений для тканей стебля без необходимости использования специализированного оборудования. Сначала соберите свежие или замороженные образцы листьев F.hispida.
Храните оставшийся свежий образец при температуре минус 20 градусов Цельсия для использования в будущем. Оставьте лист в деионизированной воде при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. С помощью чистого пробойника для биопсии разрежьте лист на диски диаметром восемь миллиметров.
Далее, чтобы промыть образцы листьев, инкубируйте их на встряхивающей пластине на низкой скорости в течение пяти-10 минут, погрузив в деионизированную воду. Затем приготовьте 10% от веса по объему SDS в деионизированной воде. После приготовления раствора SDS поместите образцы листьев на пластиковую посуду.
Затем добавьте раствор SDS, чтобы полностью покрыть образцы. Поместите образцы всплывших листьев SDS под крышкой на встряхивающую пластину, чтобы предотвратить испарение. Затем выдержите образец листа при комнатной температуре в течение пяти дней.
После пяти дней инкубации замените раствор SDS деионизированной водой. Инкубируйте образцы, замоченные в деионизированной воде, в течение 10-15 минут на встряхивающей пластине. Далее смешайте пять миллилитров неионогенного поверхностно-активного вещества с 50 миллилитрами отбеливателя.
Добавьте эту смесь в 445 миллилитров деионизированной воды. Затем поместите образцы в свежеприготовленный раствор неионогенного поверхностно-активного вещества. Продолжайте менять раствор неионогенного поверхностно-активного вещества каждые 24 часа, пока образцы не будут очищены.
Затем оставьте очищенные образцы в деионизированной воде на две минуты на встряхивающей пластине. Для децеллюляризации без использования моющих средств приготовьте пятипроцентный объемный отбеливатель в 3% массовом растворе бикарбоната натрия. Затем нагрейте раствор до 60-70 градусов Цельсия на горячей плите в вытяжном шкафу.
Как только раствор достигнет нужной температуры, замочите образцы листьев. Затем уменьшите скорость перемешивающей пластины, чтобы не повредить образцы, найдите явно очищенные образцы и осторожно перенесите их из ванны. Наконец, инкубируйте образцы в деионизированной воде в течение одной-двух минут.
Поскольку все образцы по своей сути различны, рекомендуется проверять ход децеллюляризации примерно каждые 15 минут, чтобы убедиться, что образцы не повреждены. Параметры MTM, SAF и UTS сначала изучаются для изучения уникальных свойств децеллюляризованного каркаса видов P.aquatica и F.hispida. Фактически, все три параметра демонстрируют схожие механические свойства при использовании методов децеллюляризации как на основе моющего средства, так и без него.
Тем не менее, механические свойства UTS F.hispida показывают значительно более высокое среднее значение при использовании SDS, а не отбеливателя для децеллюляризации. Содержание геномной ДНК изученных видов растений также значительно снижается при децеллюляризации по сравнению с недецеллюляризованными образцами. Далее, метаболическая активность дермальных тиранобластов человека также измеряется в присутствии децеллюляризованных скаффолдов P.aquatica или Garcinia.
Интересно, что скаффолды на основе без моющих средств оказывают меньшее влияние на клеточную метаболическую активность, но мытье с трисосоляидным буфером с последующим использованием бессывороточной среды после очистки SDS снижает влияние на клеточную метаболическую активность по сравнению с промывкой только деионизированной водой. Наконец, показан рост мезенхимальных стволовых клеток, окрашенных кальцином, на поверхности структуры листа F.hispida. После освоения эти техники могут быть выполнены примерно за семь дней до 15 минут при правильном выполнении.
При выполнении этих процедур важно не забывать следить за образцами по мере их децеллюляризации, потому что образцы могут варьироваться от партии к партии, что может привести к различному времени очистки. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как деколичественное определение или механические испытания, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как в какой степени образцы очищены и с какими другими тканями образцы механически похожи. После своего развития этот метод помог исследователям в области тканевой инженерии проложить путь к производству перфузионных каркасов.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как децеллюляризировать растительные ткани для использования в качестве каркасов. Не забывайте, что работа с моющими средствами и отбеливающими парами может быть опасной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащих защитных средств и использование вытяжного шкафа.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В данной статье представлены и сопоставлены два протокола децеллюляризации растительных тканей: подход на основе детергентов и подход без использования детергентов. Оба метода сохраняют внеклеточную матрицу, которая может служить каркасом для применений в тканевой инженерии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биоматериалы
- Тканевая инженерия
- Биология растений
Предисловие
- Техники децеллюляризации имеют решающее значение для создания каркасов.
- Каркасы могут улучшать способности передачи жидкостей.
- Методы могут применяться к различным стеблевым тканям растений.
- Для этих методов не требуется специализированное оборудование.
Цель исследования
- Сравнить методы децеллюляризации на основе детергентов и без детергентов.
- Оценить потенциал внеклеточных матриц растений в качестве каркасов.
- Решить проблемы разработки каркасов для тканевой инженерии.
Используемые методы
- Сбор свежих или замороженных образцов листьев F.hispida.
- Хранение образцов при -20 градусах Цельсия.
- Погружение листьев в деионизированную воду при температуре 20-25 градусов Цельсия.
- Разрезание листьев на круглые диски диаметром восемь миллиметров с помощью биопсии.
Основные результаты
- Оба метода децеллюляризации эффективно сохраняют внеклеточную матрицу.
- Созданные каркасы могут использоваться в различных применениях тканевой инженерии.
- Повышены способности каркасов к передаче жидкостей.
- Методы масштабируемы и применимы к большинству видов растений.
Выводы
- Техники децеллюляризации обеспечивают жизнеспособные каркасы для тканевой инженерии.
- Оба метода имеют свои преимущества и могут выбираться в зависимости от конкретных нужд.
- Будущие исследования могут исследовать дополнительные применения каркасов на основе растений.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
