Два метода для Decellularization растительных тканей для приложений, инженерия тканей
31 мая 2018 г.
Здесь мы представляем, и контраст двух протоколов используется для decellularize растительных тканей: подход на основе моющих средств и моющих средств свободный подход. Оба метода оставить позади внеклеточного матрикса в тканях растений используется, который затем может быть использован как строительные леса для ткани инженерных приложений.
Эти методы могут помочь в решении ключевых вопросов в области биоматериалов, таких как разработка каркаса с отличными возможностями переноса жидкости со сложными ультраструктурами и масштабируемым производством. Основное преимущество этих методик заключается в том, что их можно применять к большинству растений для тканей стебля без необходимости использования специализированного оборудования. Сначала соберите свежие или замороженные образцы листьев F.hispida.
Храните оставшийся свежий образец при температуре минус 20 градусов Цельсия для использования в будущем. Оставьте лист в деионизированной воде при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. С помощью чистого пробойника для биопсии разрежьте лист на диски диаметром восемь миллиметров.
Далее, чтобы промыть образцы листьев, инкубируйте их на встряхивающей пластине на низкой скорости в течение пяти-10 минут, погрузив в деионизированную воду. Затем приготовьте 10% от веса по объему SDS в деионизированной воде. После приготовления раствора SDS поместите образцы листьев на пластиковую посуду.
Затем добавьте раствор SDS, чтобы полностью покрыть образцы. Поместите образцы всплывших листьев SDS под крышкой на встряхивающую пластину, чтобы предотвратить испарение. Затем выдержите образец листа при комнатной температуре в течение пяти дней.
После пяти дней инкубации замените раствор SDS деионизированной водой. Инкубируйте образцы, замоченные в деионизированной воде, в течение 10-15 минут на встряхивающей пластине. Далее смешайте пять миллилитров неионогенного поверхностно-активного вещества с 50 миллилитрами отбеливателя.
Добавьте эту смесь в 445 миллилитров деионизированной воды. Затем поместите образцы в свежеприготовленный раствор неионогенного поверхностно-активного вещества. Продолжайте менять раствор неионогенного поверхностно-активного вещества каждые 24 часа, пока образцы не будут очищены.
Затем оставьте очищенные образцы в деионизированной воде на две минуты на встряхивающей пластине. Для децеллюляризации без использования моющих средств приготовьте пятипроцентный объемный отбеливатель в 3% массовом растворе бикарбоната натрия. Затем нагрейте раствор до 60-70 градусов Цельсия на горячей плите в вытяжном шкафу.
Как только раствор достигнет нужной температуры, замочите образцы листьев. Затем уменьшите скорость перемешивающей пластины, чтобы не повредить образцы, найдите явно очищенные образцы и осторожно перенесите их из ванны. Наконец, инкубируйте образцы в деионизированной воде в течение одной-двух минут.
Поскольку все образцы по своей сути различны, рекомендуется проверять ход децеллюляризации примерно каждые 15 минут, чтобы убедиться, что образцы не повреждены. Параметры MTM, SAF и UTS сначала изучаются для изучения уникальных свойств децеллюляризованного каркаса видов P.aquatica и F.hispida. Фактически, все три параметра демонстрируют схожие механические свойства при использовании методов децеллюляризации как на основе моющего средства, так и без него.
Тем не менее, механические свойства UTS F.hispida показывают значительно более высокое среднее значение при использовании SDS, а не отбеливателя для децеллюляризации. Содержание геномной ДНК изученных видов растений также значительно снижается при децеллюляризации по сравнению с недецеллюляризованными образцами. Далее, метаболическая активность дермальных тиранобластов человека также измеряется в присутствии децеллюляризованных скаффолдов P.aquatica или Garcinia.
Интересно, что скаффолды на основе без моющих средств оказывают меньшее влияние на клеточную метаболическую активность, но мытье с трисосоляидным буфером с последующим использованием бессывороточной среды после очистки SDS снижает влияние на клеточную метаболическую активность по сравнению с промывкой только деионизированной водой. Наконец, показан рост мезенхимальных стволовых клеток, окрашенных кальцином, на поверхности структуры листа F.hispida. После освоения эти техники могут быть выполнены примерно за семь дней до 15 минут при правильном выполнении.
При выполнении этих процедур важно не забывать следить за образцами по мере их децеллюляризации, потому что образцы могут варьироваться от партии к партии, что может привести к различному времени очистки. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как деколичественное определение или механические испытания, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как в какой степени образцы очищены и с какими другими тканями образцы механически похожи. После своего развития этот метод помог исследователям в области тканевой инженерии проложить путь к производству перфузионных каркасов.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как децеллюляризировать растительные ткани для использования в качестве каркасов. Не забывайте, что работа с моющими средствами и отбеливающими парами может быть опасной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащих защитных средств и использование вытяжного шкафа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены и сопоставлены два протокола децеллюляризации растительных тканей: метод с использованием детергентов и метод без применения детергентов. Оба метода позволяют сохранить внеклеточный матрикс, который может служить каркасом для применения в тканевой инженерии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биоматериалы
- Тканевая инженерия
- Биология растений
Теоретические основы
- Методы децеллюляризации имеют решающее значение для создания скаффолдов.
- Скаффолды могут улучшить возможности переноса жидкости.
- Данные методы могут быть применены к различным тканям стеблей растений.
- Для этих методов не требуется специализированного оборудования.
Цель исследования
- Сравнить методы децеллюляризации с использованием детергентов и без них.
- Оценить потенциал внеклеточных матриксов растений в качестве скаффолдов.
- Решить проблемы разработки скаффолдов для тканевой инженерии.
Используемые методы
- Сбор свежих или замороженных образцов листьев F.hispida.
- Хранение образцов при температуре -20 °C.
- Погружение листьев в деионизированную воду при температуре от 20 до 25 °C.
- Вырезание из листьев дисков диаметром 8 мм с помощью биопсийного панча.
Основные результаты
- Оба метода децеллюляризации эффективно сохраняют внеклеточный матрикс.
- Созданные скаффолды могут быть использованы в различных целях тканевой инженерии.
- Способность скаффолдов к переносу жидкости была улучшена.
- Методы масштабируемы и применимы к большинству видов растений.
Выводы
- Методы децеллюляризации позволяют получать жизнеспособные каркасы для тканевой инженерии.
- Оба метода обладают определенными преимуществами, и выбор между ними зависит от конкретных целей.
- Будущие исследования могут быть направлены на поиск новых способов применения каркасов растительного происхождения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Каркасы на растительной основе решают критические проблемы биоматериалов в тканевой инженерии, предлагая масштабируемые биосовместимые альтернативы аутологичным, синтетическим и полученным из животных трансплантатам. Описанные методы децеллюляризации позволяют воспроизводимо создавать каркасы с сохраненной архитектурой внеклеточного матрикса, что обеспечивает перенос жидкости и механическую функциональность, необходимые для применения в регенеративной медицине. Это делает системы на растительной основе стратегическим вариантом для снижения рисков на ранних этапах разработки каркасов в рамках доклинических исследований.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет изучить вклад внеклеточного матрикса в биосовместимость и механическую целостность каркаса.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированные рабочие процессы подготовки растительных тканей, применимые к различным видам без использования специализированного оборудования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать скаффолды с количественно определяемыми механическими свойствами (UTS, MTM, SAF) для сравнительного скрининга биоматериалов.
- Практическая ценность: обеспечивает производство готовых к анализу скаффолдов с низким воздействием на метаболизм клеток, что позволяет проводить воспроизводимые эксперименты по посеву клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает оценку ответов клеток человека (например, дермальных тиробластов, мезенхимальных стволовых клеток) на матриксах растительного происхождения.
- Практическая ценность: обеспечивает гибкость использования двух методов (с применением детергента или без него) для оптимизации свойств скаффолдов в соответствии с конкретными целями тканевой инженерии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данные методы децеллюляризации интегрируются в процесс научных открытий, обеспечивая подготовку каркасов для клеточных анализов и поддерживая переход от скрининга биоматериалов к доклинической валидации в рабочих процессах тканевой инженерии.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверить гипотезу о пригодности внеклеточного матрикса растений в качестве основы для скаффолда.
- Скрининг: Обеспечивает получение воспроизводимых скаффолдов с измеримыми механическими и биологическими показателями для сравнительного анализа.
- Аналитика: Позволяет получить количественные данные (снижение содержания геномной ДНК, метаболическая активность, UTS) для определения критериев выбора скаффолда.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от разработки биоматериала до доклинических испытаний за счет стандартизированного производства скаффолдов.
- Корпоративное повторное использование: Создает независимый от платформы протокол, адаптируемый к нескольким видам растений, что повышает эффективность использования ресурсов в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в оценке эффективности скаффолдов за счет разделения вклада клеточного компонента и внеклеточного матрикса.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизации времени инкубации, концентраций растворов и этапов промывки.
- Стратегическая ценность: Снижает барьеры при разработке, устраняя необходимость в специализированном оборудовании, что позволяет внедрить метод в более широком круге лабораторий.
- Влияние на портфель: Способствует оптимизированному продвижению с учетом рисков, предоставляя скаффолды с настраиваемыми свойствами (например, модуляция UTS с помощью SDS в сравнении с отбеливателем).
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с биоматериалами и мониторинга процесса децеллюляризации для предотвращения избыточной обработки.
- Необходим доступ к стандартному лабораторному оборудованию (шейкеру, плитке, вытяжному шкафу, биопсийному панчу) и реагентам (SDS, отбеливателю, бикарбонату натрия).
- Требуется межгрупповая стандартизация оценки конечной точки очистки (например, времени визуального осмотра) для обеспечения однородности партий.
- Требуется адаптация продолжительности инкубации в зависимости от вида растения и толщины ткани, согласно наблюдениям за вариабельностью образцов.
- Включает меры предосторожности при работе с детергентами и отбеливателем, в том числе использование СИЗ и работу в вытяжном шкафу во время этапов с нагревом.
