A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нейрофармакологической области. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост, надежен и воспроизводим для образования бета-амилоидного олигомера. Мы показываем, что демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы приготовления бета-олигомера сложны для изучения.

Сначала отрегулируйте концентрацию раствора мономера А-бета до 0,25 мг на миллилитр, добавив в пробирку 900 микролитров воды двойной дистилляции. Затем продолжайте выпаривание раствора мономера с газообразным азотом высокой чистоты до тех пор, пока объем не достигнет примерно 850 микролитров с концентрацией около 0,29 миллиграмм на миллилитр. Присутствие HR5P влияет на образование А-бета-олигомера.

Поэтому выпаривание как можно большего количества является критически важным этапом этой процедуры. Далее с помощью дважды дистиллированной воды разбавить исходный раствор куркумина до приготовления рабочего раствора 0,2 и двух микромоляров. Поддерживайте соотношение один к одному и смешивайте раствор A-бета с куркумином, чтобы достичь конечной концентрации куркумина на уровне 0,1 и одного микромоляра.

Затем оставьте раствор на магнитной мешалке. Прикрепите к магнитной мешалке пластиковую разделительную коробку. Расположите две магнитные мешалки по двум углам коробки, затем поместите пробирки с образцами в центр коробки.

Продолжайте встряхивать коробку при комнатной температуре в течение 48 часов со скоростью 60 оборотов в минуту, затем центрифугируйте пробирку при 18 000 перегрузках в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования соберите надосадочную жидкость. Для анализа на точечный блоттинг берут нитроцеллюлозную мембрану и разрезают ее на полоски шириной в один сантиметр, затем равномерно помещают два микролитра образца на полоски одну и две с интервалом между точками в 0,5 сантиметра.

При распылении образца на мембрану необходимо равномерно распределить его и контролировать различные капли, чтобы разные образцы не были связаны друг с другом. Далее выдержите полоски при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы капли высохли. Через пять минут инкубируйте полоски с 5%-ным бычьим сывороточным альбумином в течение 30 минут при комнатной температуре.

После окончания инкубации промойте полоски с буфером TBST в течение пяти минут. После промывки отсадите буфер, затем инкубируйте одну полоску с антиолигомерным антителом А11 и вторую полоску с раствором анти-А-бета антитела 6Е10 в течение часа. Через час промойте полоски с TBST в течение пяти минут каждый три раза, затем аспирируйте буфер и инкубируйте полоски с раствором вторичных антител в течение 40 минут.

После инкубации вторичных антител снова промойте полоски с TBST в течение пяти минут каждый три раза. Затем добавьте около 300 микролитров смешанной жидкости ECL на поверхность влажных полосок, затем экспонируйте полоски в автоматической системе хемилюминесцентной визуализации. Исследования ПЭМ показывают отсутствие каких-либо видимых агрегатов в растворе А-бета-мономера HFIP, однако после 48 часов инкубации те же мономера образуют олигомеры, которые в основном представляют собой шаровидные агрегаты диаметром от 10 до 80 нанометров.

При исследовании образцов, богатых мономером А-бета и олигомерами, анализу методом точечного блоттинга, было показано наличие положительных А11-положительных олигомеров А-бета в образцах, богатых олигомерами А-бета. Интересно, что А-бета 6E10 положительные А-бета пептиды присутствуют как в образцах А-бета-мономера, так и в образцах, богатых олигомерами. Затем также проводится полуколичественный анализ для экспрессии специфических антителоположительных образцов А-бета-мономера и образцов, богатых олигомерами, в процентном соотношении к контролю.

А11-положительные А-бета-пептиды значительно выше в образцах, богатых А-бета-олигомерами, по сравнению с мономерами. Напротив, А-бета 6E10 положительный А-бета пептид присутствует как в мономерных, так и в богатых олигомерами образцах. Фактически, олигомеры А-бета также инкубируются совместно с куркумином и ингибитором олигомера А-бета.

Куркумин приводит к значительному снижению относительного количества А11-положительного А-бета-олигомера с уменьшением окрашивания А11 в образцах куркумина, совместно инкубированных с А-бета-олигомером. Тем не менее, различные концентрации куркумина не влияют на количество пептидов A-бета в образцах 6E10 с положительным мономером и олигомером по сравнению с образцами с положительным A11. После освоения этой техники ее можно сделать за несколько часов, если она выполнена правильно.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению кандидатов в лекарства для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить олигомер А-бета и оценить его количество.