Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поджелудочной железы, используя эти панкреатоиды, чтобы понять, как эндокринные клетки формируются в архитектурно и клеточно сложной среде. Основное преимущество данной методики заключается в том, что панкреатоиды развивают эндокринные клетки за счет включения окружающей мезенхимы. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что поджелудочная железа очень маленькая (e10,5).

Кроме того, диссекция имеет решающее значение для образования панкреатоидов, чтобы получить достаточное количество незагрязняющих тканей. Чтобы подготовиться к вскрытию, наполните ведро со льдом и поместите в него контейнер с фосфатным солевым раствором. Очистите два тонких щипца и ножницы для рассечения 70% этанолом.

Рядом с зоной вскрытия установите емкость с не менее чем тремя боросиликатными капиллярными трубками, зажигалкой и отфильтрованными 1000 микролитровыми наконечниками пипетки. Далее пипетку не менее одного миллилитра из расчета 1,25 миллиграмма на миллилитр холода разводят в стерилизованной воде во второй лунке 12-луночной тарелки на льду. Пипет PBS в первой, третьей и четвертой лунках 12-луночной пластины.

Также пипетируйте один миллилитр 0,05%-го трипсина в 1,5-миллилитровую пробирку со льдом. После усыпления беременных мышей e10.5 в соответствии с рекомендациями IACUC опрыскайте брюшную полость 70% этанолом для очистки области. Затем с помощью ножниц и щипцов сделайте V-образный разрез в области гениталий мыши и продолжайте разрез до диафрагмы.

Осторожно иссеките матку, сделав разрез в самых верхних боковых частях матки, оттягивая орган вверх от мыши и следуя этому разрезу вниз до области гениталий, прежде чем повторить на противоположной стороне. Поместите иссеченную матку в 10-сантиметровую чашку Петри с холодной PBS. Под световым диссекционным микроскопом поместите чашку Петри и осторожно вскройте ткань матки, поместив два щипца между каждым эмбрионом и отслаивающейся тканью от желточного мешка.

Перенесите эмбрионы, аккуратно захватив желточный мешок щипцами и поместив их в 10-сантиметровую чашку Петри со свежей холодной PBS. Поставьте чашку Петри на лед. Затем поместите несколько капель PBS на 10-сантиметровую крышку чашки Петри.

Используйте эти капли для переноса эмбриона во время диссекции, поскольку экстраэмбриональные ткани удаляются для обеспечения видимости. Перенесите эмбрион в каплю PBS и аккуратно извлеките его из желточного мешка с помощью щипцов, пока остальные эмбрионы остаются в PBS на льду. Удалите головку перед перемещением эмбриона в новую каплю PBS с помощью щипцов, чтобы слегка зачерпнуть эмбрион, не повреждая ткани.

В новой капле PBS удалите четыре зачатка конечностей с помощью щипцов. Поместите щипцы в отверстие, где присутствовал зачаток конечности, и аккуратно оторвите спереди только самую внешнюю ткань. Поверните эмбрион и повторите в заднем направлении, останавливаясь на зачатке задней конечности.

В этот момент должен быть виден желудочно-кишечный тракт. Задний отдел желудочно-кишечного тракта имеет небольшой изгиб; Вставьте щипцы за этим изгибом в отверстие между желудочно-кишечным трактом и спинномозговой областью у стенки тела. Отделите желудочно-кишечный тракт, медленно продвигаясь вверх, пока не будет достигнута самая передняя область, где соединяется сердечная область.

На следующих этапах крайне важно избегать окружающих тканей в культуре, чтобы не загрязнить панкреатоиды тканью, не относящейся к поджелудочной железе. Однако, если не захватить всю почку поджелудочной железы, то количество и размер панкреатоидов будут нарушены. Переведите желудочно-кишечный тракт на свежую каплю PBS.

Продолжайте удалять наружные ткани, окружающие желудочно-кишечный тракт. Как только эта наружная ткань удалена, почку поджелудочной железы можно визуализировать позади почек печени, между желудком и кишечником. Затем возьмите щипцы и аккуратно пережмите ткань под выступающим зачатком в кишечнике и слегка приподнимите бутон поджелудочной железы.

После прищипывания участка, где бутон соединяется с кишечником, бутон отделяется. Промойте один раз в новом пузыре PBS перед тем, как перенести бутон в первую лунку 12-луночного планшета и охладите PBS на льду. Повторяйте до тех пор, пока все бутоны не будут собраны из эмбрионов и помещены в первую лунку 12-луночной пластины.

Далее поместите чашку на 12 лунок под световой диссекционный микроскоп. Подсчитайте количество успешно рассекреченных почек поджелудочной железы, чтобы впоследствии рассчитать коэффициент расщепления. Поместите отфильтрованный наконечник пипетки объемом 1000 микролитров в пипетку с прикрепленной капиллярной трубкой.

Пламенем простерилизуйте капиллярную трубку и создайте изгиб в трубке для удобства использования. С помощью капилляра перенесите бутоны во вторую лунку, содержащую холодный раствор, в течение двух минут, прежде чем переложить в третью лунку, содержащую чистый PBS. Пипетируйте бутоны вверх и вниз и перенесите их в четвертую лунку, содержащую чистый PBS.

Наконец, с помощью капиллярного аппарата перенесите бутоны в 1,5-миллилитровую трубку с 0,05% трипсина. Поместите трубку в предварительно нагретый до 37 градусов Цельсия шейкер и встряхивайте со скоростью 1 500 об/мин в течение четырех-пяти минут. После вортекса в течение примерно 10 секунд немедленно поместите пробирку в центрифугу и вращайте в течение пяти минут при 200 g.

Осторожно удалите весь раствор, кроме примерно 50 микролитров, чтобы не повредить центрифугируемые клетки. На каждую почку собирают по 400 мкл органогенезных сред к центрифугированным клеткам, проводят импульсный вихрь три раза и пластину по 100 мкл на лунку 96-луночного планшета с низким уровнем прикрепления, расщепляя шишки в соотношении один к четырем. Проверьте под микроскопом, чтобы визуализировать диссоциированные клетки, свободно плавающие.

Затем поместите чашку для культуры в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на коромысле на средних оборотах. Тщательная диссекция эмбрионов мышей на расстоянии е10,5 от маточного рога должна дать неповрежденные эмбрионы в PBS для дальнейшей диссекции. Желудочно-кишечный тракт может быть эффективно удален из эмбриона, что позволяет различить дорсальную зачатку поджелудочной железы на стыке кишечника и желудка.

В средах органогенеза эти свободно плавающие клетки, свободные от каркаса, самоорганизуются и организуются в трехмерные панкреатоиды, которые растут и сохраняются в культуре не менее 10 дней. Применение активатора протеинкиназы С в высоких концентрациях изменяет морфологию развивающихся панкреатоидов, что приводит к слабо связанным эпителиальным клеткам и усилению ветвления. Кроме того, использование трансгенных животных позволяет визуализировать клетки по мере их дифференцировки в режиме реального времени.

Для оценки ассоциации мезенхимной ткани поджелудочной железы с эпителиальными клетками поджелудочной железы может быть выполнено иммуноокрашивание на маркеры каждой ткани. Иммуноокрашивание маркера протока эндокринным маркером и ядрами выявляет многолинейное образование в панкреатоидах. Маркер мезенхимы, окрашенный совместно с маркером предшественника поджелудочной железы, показывает, что мезенхима обволакивает панкреатоид.

Развитие бета-клеток выявляется путем окрашивания эпителиального маркера и маркера бета-клеток. С помощью количественного ПЦР-анализа можно оценить транскрипты предшественников и дифференцировочных клеток, таких как гены предшественников и дифференцированные маркеры. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за один час, включая время подготовки, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить диссекцию для получения ткани поджелудочной железы от 10,5 мышей для получения панкреатоидов. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о необходимости осторожного удаления желудочно-кишечного тракта у эмбрионов, иначе будет очень трудно найти зачаток поджелудочной железы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как GSIS и ELISA, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, сколько инсулина или С-пептида вырабатывается после стимуляции глюкозой.

После своего развития этот метод проложил нам путь к изучению морфологических последствий активации PKC с использованием малых молекул. Одним из способов дальнейшей реализации данной системы является изучение влияния транскрипционного фактора экспрессии и даже проведение важных эпистазных экспериментов.