Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Общая цель этого метода заключается в изучении взаимодействия индивидуальных мРНК с полисомами во время трансляции. Профилирование полисом является мощной технологией для изучения взаимодействия мРНК с рибосомами и полисомами. Этот метод важен для изучения регуляции синтеза белка, активации трансляции и репрессии.

Здесь наша команда представляет методы полисомального фракционирования и анализа дробей на примере трех организмов. Паразит Leishmania major, культивируемые клетки человека и ткани животного происхождения. Этот подход состоит из четырех основных этапов: получение лизата, получение градиента сахарозы и ультрацентрифугирование, фракционирование полисом и сбор образцов.

Анализ фракций. Клетки из разных источников собирают, промывают и лизируют в буфере для лизиса путем пропускания через иглу или гомогенизатор Dounce. Центрифугирование используется для удаления клеточных остатков, осветляющих лизат.

Непрерывный градиент сахарозы образуется путем смешивания 10% и 50% растворов сахарозы в градиентном генераторе. Лизат загружается на вершину градиента. Ультрацентрифугирование разделяет мрНК, связанные с разным количеством рибосом.

Который контролируется УФ-детектором во время фракционирования, формируя отчетливые спектры абсорбента. Приготовление лизата. Существуют некоторые отличия в приготовлении лизата в зависимости от источника.

После получения лизата процедуры идентичны независимо от происхождения образца. Leishmania major Препарат цитоплазматического лизата. Поместите клетки Leishmania major в 30 миллилитр среды с плотностью 100 000 клеток на миллилитр.

Этот этап проводится в шкафу биобезопасности. Поместите колбу с культурой лейшмании в инкубатор и выращивайте клетки при температуре 27 градусов Цельсия, до логарифмической фазы. Обычно на рост уходит около двух дней.

Клетки Leishmania major хорошо видны под микроскопом. Добавьте циклогексимид в выращенную культуру Leishmania до конечной концентрации 100 мкг на миллилитр, чтобы остановить рибосомы на транслируемых мРНК. Поместите клетки обратно в инкубатор на десять минут при температуре 27 градусов Цельсия.

После завершения обработки циклогексимидом переложите клетки в коническую трубку объемом 50 миллилитров и закрутите ее до 1800 г в течение 8 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте ячейки 30 миллилитрами пбс и центрифугой.

Откажитесь от надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре пб. Возьмите аликвоту клеток и смешайте ее с раствором формальдегида. Затем подсчитывают клетки по гемоцитометру.

Перенесите нужное количество клеток в микропробирку. Вращайте ячейки при 1 800 г в течение 8 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса, содержащего ингибиторы протеазы и РНКсин. Пропустите ячейки через иглу 23 калибра три раза. После прохождения через иглу лизат становится прозрачным.

Центрифугируйте при 11, 200 г в течение десяти минут при четырех градусах Цельсия для осветления лизата. Переложите осветленный лизат в свежую микропробирку и держите ее на льду до ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Препарат цитоплазматического лизата из культивируемых клеток человека.

Выращивайте клетки HeLa в большой тарелке в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2. Добавьте циклогексимид в выращенные клетки HeLa до конечной концентрации 100 микрограммов на миллилитр, чтобы остановить рибосомы на транслируемых мРНК. Инкубируйте клетки в течение десяти минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2.

Отсадите medium и дважды промойте пластину на льду холодными пб. Добавьте в пластину 500 микролитров буфера для лизиса и соскребите клетки. Перенесите лизированные клетки в микрофугальную пробирку.

Пропустите ячейки через иглу 23 калибра три раза. Крутите при 11, 200 г в течение восьми минут, чтобы осветлить лизат. После центрифугирования переместите пробирки на лед, а надосадочную жидкость перенесите в новую пробирку.

Возьмите аликвоту, разбавьте ее и измерьте поглощение на 260 нанометрах с помощью нанокапли. Если образцов несколько, отрегулируйте лизаты до одинаковой оптической плотности и держите образцы на льду до ультрацентрифугирования с градиентом сахарозы. Препарат цитоплазматического лизата из яичек мыши.

Рассеките яичко мыши. Сделайте небольшой надрез в белочной оболочке и соберите семенные канальцы семенника и перенесите их в коническую трубку, содержащую пять миллилитров пб. Энергично перемешайте ткань.

И дайте ткани осесть на льду в течение пяти минут. Снимите буфер, и промойте его с помощью пбс еще два раза. Переложите семенные канальцы в двухмиллилитровую трубку и закрутите их при давлении 500 г в течение одной минуты.

Удалите надосадочную жидкость. Добавьте 500 микролитров буфера для лизиса в канальцы и с помощью пипетки нарушите работу тканей. Переложите суспензию в гомогенизатор небольшого объема.

Разрушьте ткань семью-восемью ударами стеклянного пестика. Перенесите лизат в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте образец при 12 000 г при четырех градусах Цельсия в течение восьми минут, чтобы очистить лизат.

Переложите надосадочную жидкость в новую трубку и держите ее на льду. Затем приступаем к приготовлению градиента сахарозы. Приготовление градиента сахарозы.

Поместите в микроблок ультрацентрифужную пробирку и проведите линию по верхнему уровню блока. Затем переложите пробирку в устойчивую стойку. Возьмите десятимиллилитровый шприц, с прикрепленным устройством для наслоения и наполните шприц 10%-ным раствором сахарозы.

Аккуратно выпустите его на дно ультрацентрифужной пробирки, пока раствор сахарозы не достигнет отметки. Наполните еще один шприц 50%-ным раствором сахарозы и осторожно вставьте его наслоение устройством через 10%-ный слой сахарозы на дно пробирки. Аккуратно выпустите раствор сахарозы, начиная снизу до тех пор, пока он не достигнет отметки на тюбике.

Затем закройте пробирку прилагаемой крышкой. Чтобы приготовить градиент сахарозы, включите устройство для создания градиента. Затем выровняйте пластину с помощью кнопок вверх или вниз и нажмите готово.

После выравнивания плиты вдавить град. Перейдите в список градиентного меню и выберите ротор SW41. Затем выберите желаемый градиент сахарозы.

Используйте прессу. Поместите держатель магнитной трубы на градиентный генератор. Затем переложите трубку в держатель.

Одновременно можно подготовить до шести градиентов. Нажмите run. Градиентизатор вращает трубки с программной скоростью и углами, формируя линейный градиент.

На подготовку градиента уйдет всего несколько минут. Когда процесс будет завершен, поместите пробирку в решетку. Снимите объем, равный объему образца, с верхней части ультрацентрифужных пробирок с градиентами сахарозы.

Аккуратно загрузите сверху 500 микролитров лизата. Поместите трубки в ведра с ротором и отбалансируйте их. Центрифугируйте при 260 000 г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.

Фракционирование полисом и забор образцов. После ультрацентрифугирования поместите пробирки в ведра ротора на лед. Включите сборник фракций и ректификатор.

Нажмите кнопку «Сканировать» в меню ректификатора. Поместите штатив со сборными пробирками в сборник фракций. Наполните резервуар для промывки, расположенный сбоку от ректификатора, деионизированной водой.

Нажмите кнопку полоскания и удерживайте ее в течение десяти секунд, чтобы промыть насос. Прикрепите адаптер для промывки со шприцем, наполненным водой, к поршню для калибровки. Откройте программное обеспечение ректификационного аппарата на компьютере.

Нажмите кнопку калибровки. Используйте настройку по умолчанию и нажмите Ok.Be, чтобы ввести воду из шприца. Нажмите Ok для выполнения калибровки.

Немедленно начните вводить воду в течение следующих пяти секунд. Появится знак Калибровка нуля завершена. Снимите адаптер для промывки с помощью шприца и прикрепите наконечник к поршню ректификатора.

Откройте латунный воздушный клапан и нажмите воздушный ключ в течение десяти секунд, чтобы высушить трубку воздуха и проточную ячейку. Закройте воздушный клапан. Возьмите градиентную трубку из ведра ротора и поместите ее в стойку.

Наденьте колпачок держателя пробирки на верхнюю часть пробирки, осторожно переместите пробирку в держатель пробирки и зафиксируйте ее. Поместите держатель под поршень. Часто полисомальные полосы можно увидеть на глаз.

Введите желаемые настройки для количества дробей и объема. Назовите файл и нажмите Ok, затем перейдите к кнопке графика. В следующем окне нажмите кнопку «Начать сканирование».

Появятся настройки, и нажмите Ok. Коллектор переместится от желоба к первой фракции, а поршень переместится в трубку. Когда поршень достигнет вершины градиента, он замедлится до выбранной вами скорости, и будут собираться дроби. Обычно мы собираем 24 фракции по 500 микролитров каждая.

Когда это будет завершено, поршень выйдет из градиентной трубы. Откройте латунный воздушный клапан. Нажмите воздушную клавишу на ректификаторе, чтобы извлечь последнюю фракцию.

В конце пробега вы увидите профиль поглощения градиента. Анализ фракций. Полученные фракции могут быть использованы для анализа РНК и белка.

РНК может быть проанализирована с помощью электрофореза с последующим Нозерн-блотом или использована для производства кДНК с последующей реакцией ОТ-кПЦР для анализа ассоциации отдельных мРНК с полисомами. Секвенирование нового поколения может быть использовано для анализа трансляционного статуса мРНК в масштабе транскриптома. Для белкового анализа полисомальных фракций белки осаждают трилурицедиевой кислотой для их концентрирования.

Затем белки анализируются с помощью Western Blotting или Mass Spec на уровне протеома. Результаты. Здесь мы представляем результаты фракционирования и анализа полисом на примерах трех организмов. Leishmania, культивируемые человеческие клетки и ткани мыши.

Фракционирование полисом было использовано для изучения связи мРНК Шерпа и тубулина с рибосомами во время трансляции и большой лейшмании. График поглощения для фракционирования имеет четкую форму с типичными пиками для субъединиц рибосом 40S и 60S, моносом 80S и полисом. Аликвоты дробей были объединены в три группы.

Предполисомы, легкие полисомы и тяжелые полисомы. Относительные уровни мРНК изучали методом количественной ПЦР в реальном времени. Полученные данные свидетельствуют о том, что мРНК тубулина активно транслируется.

Так как он в основном ассоциировался с тяжелыми и легкими полисомами. В то время как трансляция мРНК Sherp менее активна. В основном он был обнаружен в ассоциации с преполисомами и легкими полисомами.

Таким образом, данный эксперимент наглядно демонстрирует способность методики изучать участие отдельной мРНК в трансляции. На этом рисунке представлен типичный график поглощения полисомного фракционирования клеток HeLa. Белки концентрировали путем осаждения с 10% трихлоруксусной кислотой.

Малая субъединица рибосомального белка RPS6 и большая субъединица рибосомального белка RPL11 были обнаружены с помощью Western Blot. Их распределение хорошо коррелировало с отчетливыми пиками в спектре поглощения. На этом рисунке представлен пример детекции рибосомальных РНК методом электрофореза в фракционированных полисомах из яичка мыши. Выводы.

Полисомальное профилирование является универсальным методом, который может быть использован для анализа трансляционного состояния отдельных мРНК, изучения рибосом-ассоциированных белков и изучения трансляционной регуляции в различных модельных организмах в различных условиях.