Кандидат Джин тестирование в клинической когортных исследований с мультиплексной генотипирования и масс-спектрометрии
21 июня 2018 г.
Определение генетических вариантов, способствующих сложных заболеваний человека позволяет нам выявить новых механизмов. Здесь мы продемонстрировать мультиплекс генотипирования подход к кандидату генов или гена путь анализа, который максимизирует покрытия при низких затратах и поддается на основе когортных исследований.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клинической диагностики и генетики, такие как выявление генетических маркеров, связанных с исходами заболевания, в том числе вируса папилломы человека. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это экономически эффективный, целенаправленный и эффективный по времени метод диагностики. Чтобы начать эту процедуру, восстановите все заказанные лиофилизированные праймеры с помощью молекулярной воды.
Вытяните прямой и обратный праймеры для каждого мультиплексного анализа в смесь праймеров таким образом, чтобы она содержала каждый праймер в концентрации ноль целых пять целых миллимолара. После этого приготовьте мастер-смесь для ПЦР, как указано в текстовом протоколе. Добавьте четыре микролитра этой смеси в каждую лунку 384-луночного ПЦР-планшета вместе с одним микролитром геномной ДНК в концентрации от пяти до 10 нанограммов на микролитр.
Накройте пластину крышкой для тарелки и центрифугируйте в 200 раз больше G в течение одной минуты при комнатной температуре. Затем запустите ПЦР, как указано в текстовом протоколе. Загрузите один микролитр ПЦР-продукта с тремя микролитрами загрузочного буфера на 2%-ный агарозный гель.
Работайте при напряжении 100 вольт в течение 45 минут, чтобы убедиться, что амплификация ДНК прошла успешно. Затем подготовьте мастер-микс SAP, как указано в текстовом протоколе. Добавьте по два микролитра свежеприготовленной мастер-смеси SAP в каждую лунку ранее запущенного ПЦР-планшета.
Кратковременно центрифугируйте при 1000 умноженных на G в течение одной минуты. А затем верните пластину в термоамплификатор. Запустите термоамплификатор при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут.
А затем при 85 градусах Цельсия в течение пяти минут инактивировать фермент. После расчета коэффициента разбавления для каждого праймера объедините определенные объемы каждого из них, чтобы составить пул праймеров. Добавляйте воду по мере необходимости, чтобы разбавить этот бассейн.
Соберите расширенный мастер-микс для анализа с высоким или низким уровнем плекса, как указано в текстовом протоколе. Добавьте по два микролитра мастер-смеси для наращивания в каждую лунку пластины, доведя общий объем в каждой лунке до девяти микролитров. Кратковременно центрифугируйте при 1000 G в течение одной минуты, а затем верните пластину в термоамплификатор.
После этого добавьте в каждую лунку по 16 микролитров деионизированной воды, доведя общий объем до 25 микролитров на лунку. Равномерно нанесите шесть миллиграммов смолы на всю пластину с ямочкой. Дайте смоле высохнуть в течение 20 минут при комнатной температуре.
Затем нанесите смолу на реакционную пластину. С помощью суспензионного миксера вращайте тарелку на медленной скорости в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифугируйте планшет при 3,200 G в течение пяти минут, чтобы избежать нанесения смолы на чип масс-спектра.
Загрузите образец схемы расположения пластины в программный интерфейс системы. С помощью дозирующей системы нанесите смесь аналита для генотипирования с планшета на чип для генотипирования. Загрузите чип в систему MALDI-TOF, чтобы сгенерировать масс-спектры из смеси аналита и интерпретировать их с помощью программного интерфейса платформы.
В данном исследовании мультиплексное генотипирование осуществляется с помощью масс-спектрометрии. Репрезентативные данные SNP генерируются и анализируются для гена-кандидата IL13 в исследовательской клинической когорте, фенотипированной по пищевой аллергии. Один из вариантов, rs1295686, связан с доказанной пищевой аллергией.
Эта ассоциация подтверждена в репликационной когорте с использованием мультиплексного подхода генотипирования, продемонстрированного в данном протоколе. Мета-анализ результатов из двух когорт дает убедительные доказательства связи между IL13 и FA. При попытке выполнить эту процедуру важно не загрязнить образцы или реагенты. Также важно готовить дополнительную 10%-ную мастер-смесь для каждой ПЦР, чтобы учесть любую ошибку пипетирования.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, коррелирует ли экспрессия генов с идентифицированными генетическими маркерами, связанными с заболеванием. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клинической диагностики и генетики к изучению ассоциаций заболеваний в когортах пациентов. Не забывайте, что при работе с генотипированием реактивы и система MALDI-TOF могут быть опасны, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как ношение перчаток и лабораторного халата.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод мультиплексного генотипирования для анализа генов-кандидатов, связанных со сложными заболеваниями человека. Этот метод является экономически эффективным и подходит для когортных исследований, расширяя возможности обнаружения генетических маркеров, ассоциированных с исходами заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Клиническая диагностика
- Обнаружение патогенов
Теоретическая часть
- Идентификация генетических вариантов помогает в понимании механизмов заболеваний.
- Экономически эффективные методы имеют решающее значение для крупномасштабных исследований.
- Мультиплексное генотипирование может повысить эффективность диагностики.
- Вирус папилломы человека является примером мишени для обнаружения генетических маркеров.
Цель исследования
- Разработать метод мультиплексного генотипирования для анализа генов-кандидатов.
- Максимизировать охват при минимизации затрат.
- Облегчить проведение когортных исследований в области генетики.
Используемые методы
- Восстановление лиофилизированных праймеров водой молекулярно-биологического качества.
- Приготовление стокового смеси праймеров в концентрации 0.5 millimolar.
- Приготовление мастер-микса для ПЦР согласно описанному протоколу.
- Использование 384-луночного ПЦР-планшета для анализа геномной ДНК.
Основные результаты
- Метод продемонстрировал эффективность в обнаружении генетических маркеров.
- Экономическая эффективность была подтверждена в ходе практического применения.
- В процессе диагностики была отмечена высокая временная эффективность.
- Успешное применение для обнаружения вируса папилломы человека.
Выводы
- Метод мультиплексного генотипирования является ценным инструментом в генетике.
- Он создает основу для будущих исследований сложных заболеваний.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения в клинической диагностике.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Мультиплексное генотипирование с помощью масс-спектрометрии позволяет проводить экономически эффективный высокопроизводительный анализ генетических вариантов в клинических когортах, что способствует валидации мишеней при исследовании сложных заболеваний. Данный подход повышает прогностическую достоверность, связывая такие локусы-кандидаты, как IL13, с фенотипическими исходами, например, с пищевой аллергией, посредством статистически надежных исследований ассоциаций. Это делает генетический скрининг масштабируемым инструментом поиска, позволяющим снизить риски при проверке терапевтических гипотез на ранних этапах научно-исследовательских разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: проверка терапевтических гипотез путем исследования ассоциаций между генетическими вариантами и фенотипами заболеваний в клинически значимых когортах.
- Практическая ценность: позволяет одновременно анализировать до 40 SNP за один анализ, что повышает эффективность валидации мишеней на уровне сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе IL13 в качестве терапевтической мишени посредством репликации и метаанализа ассоциаций между генотипом и фенотипом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Использование неравновесного сцепления позволяет максимизировать геномный охват при минимальном выборе SNP, что повышает эффективность разработки анализа.
- Операционная ценность: Считывание методом MALDI-TOF обеспечивает количественные данные генотипирования с высоким разрешением, подходящие для автоматизированных конвейеров анализа.
- Масштабируемость: Формат ПЦР в 384-луночных планшетах обеспечивает высокую пропускную способность образцов для кампаний по скринингу когорт.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает генетические данные, полученные в человеческих когортах, с путями функциональной валидации, что способствует выбору мишеней, соответствующих биомаркерам.
- Продвижение с учетом рисков: репликация в независимых когортах повышает уверенность при переходе от этапа поиска к доклиническим инвестициям.
- Механистическое понимание: позволяет проводить последующие исследования (например, корреляцию экспрессии генов) для выяснения биологических механизмов, лежащих в основе генетических ассоциаций.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от генетического скрининга до идентификации ведущих соединений, обеспечивая формирование генетически стратифицированных когорт для последующей валидации мишеней и скрининга соединений.
- Открывающая биология (Discovery Biology): Проверка генетических гипотез в фенотипированных клинических когортах для выяснения путей развития заболеваний и приоритизации мишеней.
- Скрининг: Получение стандартизированных, воспроизводимых данных о генотипе, что обеспечивает надежную стратификацию образцов для функциональных анализов.
- Аналитика: Выдача высокоточных результатов генотипирования с порогами контроля качества, что позволяет проводить статистическое сравнение между различными состояниями и когортами.
- Трансляционные исследования: Связь результатов генетических исследований человека с доклинической валидацией путем выявления вариантов с сильной фенотипической ассоциацией.
- Корпоративное повторное использование: Дизайн мультиплексного анализа может быть адаптирован для различных генов и заболеваний, что обосновывает инвестиции в инфраструктуру генотипирования на уровне платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет статистически подтвержденных генетических ассоциаций в клинически значимых популяциях.
- Операционная ценность: Снижает стоимость анализа одного образца за счет мультиплексирования и оптимизирует рабочий процесс благодаря интегрированным этапам ПЦР, достройки и MALDI-TOF детекции.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя генетические данные человека, которые снижают риски при выборе мишени на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе репликации и величины эффекта в когортных исследованиях.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области разработки генетических тестов, оптимизации ПЦР и интерпретации данных MALDI-TOF.
- Метод зависит от наличия систем масс-спектрометрии с возможностью мультиплексного анализа и валидированного программного обеспечения для генотипирования.
- Необходимы стандартизированные протоколы обработки образцов и контроля качества для обеспечения воспроизводимости результатов между различными центрами или партиями.
- Адаптация под новые мишени требует отбора SNP на основе неравновесного сцепления (LD) и тестирования совместимости праймеров при мультиплексном анализе.
- Практические ограничения включают чувствительность к качеству ДНК образца и необходимость осторожного обращения с реагентами для предотвращения контаминации.
