In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки

Эта рукопись описывает протокол для изучения Антимикробный эффект 5-аминолевулиновой кислоты опосредованной фотодинамической терапии (ALA-PDT) на золотистый стафилококк биопленки. Этот протокол может использоваться для разработки в vitro модель для изучения в будущем лечении бактериальных биопленок с PDT.

Общей целью данного эксперимента является оценка антимикробного действия пятиаминолевулиновой кислоты или фотодинамической терапии, опосредованной ALA, на биопленку золотистого стафилококка. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области бактериальной биопленки о том, как фотодинамическая репарация клеток может быть использована в качестве альтернативного лечения для контроля биопленочных инфекций. Преимущество этой процедуры заключается в том, что она может быть использована для других бактерий с минимальной корректировкой.

Чтобы получить биопленку в 96-луночном планшете, сначала инокулируйте один минус 80 градусов Цельсия ThOD Staphylococcus aureus США триста в трех биопленочных образующих клинических культурах штамма в отдельных 14-миллилитровых пробирках с круглым дном, содержащих пять миллилитров триптонного соевого бульона, или TSB, среды, в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с встряхиванием на ночь. Когда культуры достигнут стационарной фазы, бактериальные клетки центрифугируют и повторно суспендируют гранулы и PBS в соотношении от двух до 10 до девятой колониеобразующей единицы на миллилитр концентрации. Разбавляют эти бактериальные суспензии в соотношении 1 к 200 и среду TSB, дополненную нулем пяти десятых процента глюкозы и семян 200 микролитров бактериальных клеток на лунку в три лунки на штамм на опытную группу в полистирольной клеточной культуре, обработанной 96-луночным микропланшетом для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия, с кислородом. без тряски.

На следующий день аккуратно трижды промойте лунки PBS, не потревожив биопленки. Далее добавьте 200 микролитров свежеприготовленной АЛК в соответствующие экспериментальные лунки, и поместите пластину при температуре 25 градусов Цельсия на один час в защищенном от света месте. Затем облучите пластину светодиодом с интенсивностью света 100 милливатт на квадратный сантиметр в течение одного часа.

Чтобы подсчитать количество жизнеспособных бактерий в группе в конце фототерапии, осторожно промойте каждую лунку три раза PBS, чтобы удалить любые неадгезивные клетки. Затем с помощью наконечника пипетки соскребите прилипшие бактерии со дна каждой лунки. Вытащите клетки из каждой группы в одну пробирку Эппендорфа в каждом экспериментальном условии и гранулируйте клетки центрифугированием.

Повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре 0,25-процентного фермента панкреатина и PBS в течение 90-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия, после чего следует еще одно центрифугирование. Повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS и сделайте от одного до 10 последовательных разведений каждой группы, добавив пять микролитров серийно разведенного образца на отдельные пластины триптонного соевого агара. Затем инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов и подсчитайте количество колоний бактерий в группе.

Для оценки биопленок с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии генерируют и облучают биопленки, как показано на рисунке. Облученные биопленки промойте PBS и окрашивайте живые и мертвые клетки одним миллилитром зеленого флуоресцентного ядерного и хромосомного красителя, проницаемым для мембраны прокариотических клеток, и одним миллилитром одного микромолярного йодида пропидия соответственно. Через 20 минут удалите излишки пятна и визуализируйте биопленки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под объективом с температурой погружения в 63 раза 1,4 NA.

Жизнеспособность биопленочных бактерий снижается после двойного лечения фототерапией ALA по сравнению с жизнеспособностью биопленочных бактерий в контрольной группе или без нее и всеми четырьмя протестированными штаммами. Визуализация биопленок с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии подтверждает этот вывод, при этом большинство клеток, положительных на йодид пропидия, наблюдались в группе двойного лечения фототерапией ALA. При проведении этой процедуры важно помнить, что все манипуляции с бактериями, обработанными ALA, должны выполняться в темноте, а с биопленкой материала следует обращаться осторожно, чтобы не нарушить образовавшуюся биопленку.

Это сообщение может быть применено для изучения антимикробного эффекта фотодинамической терапии на бактериальную биопленку in vitro исследователями в области бактериальных инфекций.