In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки
16 апреля 2018 г.
Эта рукопись описывает протокол для изучения Антимикробный эффект 5-аминолевулиновой кислоты опосредованной фотодинамической терапии (ALA-PDT) на золотистый стафилококк биопленки. Этот протокол может использоваться для разработки в vitro модель для изучения в будущем лечении бактериальных биопленок с PDT.
Общей целью данного эксперимента является оценка антимикробного действия пятиаминолевулиновой кислоты или фотодинамической терапии, опосредованной ALA, на биопленку золотистого стафилококка. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области бактериальной биопленки о том, как фотодинамическая репарация клеток может быть использована в качестве альтернативного лечения для контроля биопленочных инфекций. Преимущество этой процедуры заключается в том, что она может быть использована для других бактерий с минимальной корректировкой.
Чтобы получить биопленку в 96-луночном планшете, сначала инокулируйте один минус 80 градусов Цельсия ThOD Staphylococcus aureus США триста в трех биопленочных образующих клинических культурах штамма в отдельных 14-миллилитровых пробирках с круглым дном, содержащих пять миллилитров триптонного соевого бульона, или TSB, среды, в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с встряхиванием на ночь. Когда культуры достигнут стационарной фазы, бактериальные клетки центрифугируют и повторно суспендируют гранулы и PBS в соотношении от двух до 10 до девятой колониеобразующей единицы на миллилитр концентрации. Разбавляют эти бактериальные суспензии в соотношении 1 к 200 и среду TSB, дополненную нулем пяти десятых процента глюкозы и семян 200 микролитров бактериальных клеток на лунку в три лунки на штамм на опытную группу в полистирольной клеточной культуре, обработанной 96-луночным микропланшетом для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия, с кислородом. без тряски.
На следующий день аккуратно трижды промойте лунки PBS, не потревожив биопленки. Далее добавьте 200 микролитров свежеприготовленной АЛК в соответствующие экспериментальные лунки, и поместите пластину при температуре 25 градусов Цельсия на один час в защищенном от света месте. Затем облучите пластину светодиодом с интенсивностью света 100 милливатт на квадратный сантиметр в течение одного часа.
Чтобы подсчитать количество жизнеспособных бактерий в группе в конце фототерапии, осторожно промойте каждую лунку три раза PBS, чтобы удалить любые неадгезивные клетки. Затем с помощью наконечника пипетки соскребите прилипшие бактерии со дна каждой лунки. Вытащите клетки из каждой группы в одну пробирку Эппендорфа в каждом экспериментальном условии и гранулируйте клетки центрифугированием.
Повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре 0,25-процентного фермента панкреатина и PBS в течение 90-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия, после чего следует еще одно центрифугирование. Повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS и сделайте от одного до 10 последовательных разведений каждой группы, добавив пять микролитров серийно разведенного образца на отдельные пластины триптонного соевого агара. Затем инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов и подсчитайте количество колоний бактерий в группе.
Для оценки биопленок с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии генерируют и облучают биопленки, как показано на рисунке. Облученные биопленки промойте PBS и окрашивайте живые и мертвые клетки одним миллилитром зеленого флуоресцентного ядерного и хромосомного красителя, проницаемым для мембраны прокариотических клеток, и одним миллилитром одного микромолярного йодида пропидия соответственно. Через 20 минут удалите излишки пятна и визуализируйте биопленки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии под объективом с температурой погружения в 63 раза 1,4 NA.
Жизнеспособность биопленочных бактерий снижается после двойного лечения фототерапией ALA по сравнению с жизнеспособностью биопленочных бактерий в контрольной группе или без нее и всеми четырьмя протестированными штаммами. Визуализация биопленок с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии подтверждает этот вывод, при этом большинство клеток, положительных на йодид пропидия, наблюдались в группе двойного лечения фототерапией ALA. При проведении этой процедуры важно помнить, что все манипуляции с бактериями, обработанными ALA, должны выполняться в темноте, а с биопленкой материала следует обращаться осторожно, чтобы не нарушить образовавшуюся биопленку.
Это сообщение может быть применено для изучения антимикробного эффекта фотодинамической терапии на бактериальную биопленку in vitro исследователями в области бактериальных инфекций.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается протокол изучения антимикробного действия фотодинамической терапии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (ALA-PDT) в отношении биопленки Staphylococcus aureus. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области исследования бактериальных биопленок, касающиеся альтернативных способов борьбы с инфекциями, вызванными биопленками.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Фотодинамическая терапия
- Исследование биопленок
Теоретическая база
- Staphylococcus aureus является распространенным патогеном, связанным с инфекциями, вызванными биопленками.
- Фотодинамическая терапия (ФДТ) — это метод лечения, при котором для уничтожения бактерий используются светоактивируемые соединения.
- 5-аминолевуленовая кислота (ALA) является предшественником в синтезе фотосенсибилизаторов, используемых в ФДТ.
- Данное исследование направлено на разработку модели in vitro для тестирования ALA-ФДТ на бактериальных биопленках.
Цель исследования
- Оценить антимикробный эффект ФДТ с использованием ALA в отношении биопленок Staphylococcus aureus.
- Изучить потенциал ФДТ как альтернативного метода лечения инфекций, связанных с биопленками.
- Разработать протокол, который может быть адаптирован для других бактериальных штаммов.
Используемые методы
- Инокуляция Staphylococcus aureus в триптон-соевый бульон (TSB) для формирования биопленок.
- Инкубация культур при 37 °C до достижения стационарной фазы.
- Центрифугирование и ресуспендирование бактериальных клеток в PBS.
- Посев бактериальных клеток в 96-луночный микропланшет для проведения ФДТ.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно создавать биопленки, пригодные для тестирования ALA-PDT.
- ALA-PDT продемонстрировала потенциальный антимикробный эффект в отношении биопленок Staphylococcus aureus.
- Метод может быть адаптирован для других бактериальных штаммов с минимальными корректировками.
- Для оптимизации условий лечения необходимы дальнейшие исследования.
Выводы
- ALA-PDT является перспективным подходом к лечению бактериальных биопленок.
- Данное исследование закладывает основу для будущих изысканий в области фотодинамической терапии.
- Понимание механизмов PDT может привести к совершенствованию стратегий лечения инфекций, связанных с образованием биопленок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная модель in vitro позволяет провести механистическую оценку фотодинамической терапии (ФДТ) при инфекциях, связанных с биопленками, что является актуальной проблемой при разработке противомикробных препаратов. Благодаря количественному определению колониеобразующих единиц и визуализации жизнеспособности с помощью конфокальной микроскопии, данный анализ обеспечивает воспроизводимые количественные данные для снижения рисков при отборе кандидатов для ФДТ на ранних этапах разработки. Платформа поддерживает валидацию мишеней и идентификацию ведущих соединений для стратегий борьбы с биопленками, что особенно актуально для Staphylococcus aureus и других патогенов, способных формировать биопленки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: проверка терапевтической гипотезы об эффективности ALA-PDT против биопленок S. aureus путем анализа снижения КОЕ и окрашивания на жизнеспособность.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени путем установления связи между активацией фотосенсибилизатора и механизмами уничтожения бактерий в контролируемой модели биопленки.
- Прогностическая ценность: обосновывает принятие доклинических решений о целесообразности дальнейших исследований, демонстрируя дозо- и времязависимые антимикробные эффекты в стандартизированных условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение зрелых, воспроизводимых биопленок S. aureus в 96-луночном формате, подходящем для высокопроизводительного скрининга соединений для ФДТ.
- Количественные результаты: предоставляет данные подсчета КОЕ и данные конфокальной микроскопии в качестве ортогональных показателей для оценки эффективности соединений и степени проникновения в биопленку.
- Повторное использование платформы: адаптируема к другим бактериальным штаммам и фотосенсибилизаторам с минимальными корректировками протокола, что позволяет применять ее для широкого спектра антиинфекционного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует клинически значимые инфекции, вызванные биопленками S. aureus, обеспечивая переход от результатов in vitro к доклинической валидации антиинфекционных средств на основе ФДТ.
- Снижение механистических рисков: Позволяет прояснить механизм ФДТ с помощью окрашивания живых/мертвых клеток, уменьшая неопределенность в путях эрадикации биопленок.
- Трансляционная преемственность: Обосновывает решения о дальнейшем развитии исследований, предоставляя воспроизводимые данные по ингибированию биопленок для нескольких штаммов и экспериментальных повторностей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ вписывается в общий процесс разработки антибактериальных препаратов — от валидации мишени и оптимизации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, особенно для методов воздействия на биопленки.
- Биологические исследования: Проверка механистических гипотез разрушения биопленки и потери жизнеспособности бактерий, индуцированных ФДТ, в физиологически релевантной модели.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированной оценки фотосенсибилизаторов и параметров дозы света для анализа антибиопленочной активности.
- Аналитика: Предоставление показателей снижения КОЕ и метрик жизнеспособности на основе флуоресценции для сравнения условий обработки и изучения зависимостей «структура — активность».
- Трансляционные исследования: Связь ингибирования биопленок in vitro с моделями доклинической эффективности посредством количественных и воспроизводимых конечных точек.
- Корпоративное использование: Создание модульной платформы ФДТ для борьбы с биопленками, применимой к различным патогенам и хемотипам фотосенсибилизаторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность во взаимодействиях при ФДТ-биопленках за счет прямой визуализации и количественной оценки гибели бактерий.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированный, защищенный от света рабочий процесс с определенными этапами инкубации, облучения и считывания результатов для обеспечения воспроизводимости между лабораториями.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность в принятии решений о продолжении или прекращении разработки кандидатов для ФДТ путем предоставления ранних данных об эффективности в клинически значимой модели биопленки.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию программ ФДТ с учетом рисков путем выявления соединений с доказуемым проникновением в биопленку и антимикробной активностью.
Особенности реализации
- Требуются навыки владения микробиологическими методами, культивированием биопленок и соблюдения протоколов фотобиологической безопасности.
- Необходимость использования оборудования для контролируемого светового облучения (например, измерителя облученности СИД) и флуоресцентного микроскопа или планшетного ридера для подсчета КОЕ и получения изображений.
- Требуется стандартизация приготовления ALA, времени инкубации и условий подачи света во всех экспериментальных группах для обеспечения воспроизводимости.
- Адаптация метода для других бактериальных штаммов может потребовать оптимизации условий формирования биопленки и эффективности поглощения фотосенсибилизатора.
- Практическое ограничение: чувствительность биопленки может варьироваться в зависимости от фазы роста и состава матрикса, что требует тщательного контроля при проведении сравнительных исследований.
