Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Большой проблемой остается загрязнение в ходе секвенирования геномных микроскопических организмов. Здесь мы покажем способ последовательности генома тихоходки от одного образца с всего лишь 50 pg геномной ДНК без усиления весь геном свести к минимуму риск загрязнения.

Целью этого протокола является секвенирование генома микроскопического организма, называемого тихоходками. Мы разработали метод секвенирования генома тихоходки, Hypsibius dujardini, из одного образца с 50 пикограммами геномной ДНК с применением всего генома. После выделения одной тихоходки мы сводим к минимуму бактериальное загрязнение с помощью антибиотиков и визуального осмотра.

Мы также использовали два метода гомогенизации. Первое и наиболее часто используется у C.elegans с использованием циклов замораживания и размораживания, а во-вторых, ручное дробление тихоходки с помощью наконечника пипетки. Затем ДНК используется для создания библиотеки секвенирования, а затем секвенируется в приборе MiSeq.

Общее резюме протокола. После изоляции одной особи ее подвергают трем циклам замораживания и оттаивания для гомогенизации. Геномная ДНК извлекается и очищается, а затем фрагментируется с помощью ультразвука.

Затем создается библиотека секвенирования, и после проверки распределения размеров библиотеки она секвенируется с помощью инструмента секвенирования. Приготовьте 2%-ный агарозный гель, используя дистиллированную воду в качестве растворителя в 90-миллиметровой пластиковой чашке для культивирования, и 10 миллиметров 1%-ного пенициллинового стрептомицина с дистиллированной водой. Гель можно хранить в течение двух-трех недель в инкубаторе, установленном при температуре 18 градусов.

Соберите одну тихоходку и выложите на подготовленную агаровую пластину, а два -три раза промойте дистиллированной водой, чтобы удалить оставшиеся частички. Поместите одиночную тихоходку в антибиотики со стрептомицином пенициллина на два-шесть часов, чтобы удалить бактериальное загрязнение, и поместите обеззараженное животное на чистое предметное стекло с помощью пипетки P10. Понаблюдайте за тихоходкой под микроскопом при 500-кратном увеличении и убедитесь, что в ней не осталось бактерий.

Соберите индивидуума с помощью пипетки P10 с максимум пятью микролитрами жидкости и поместите в ПЦР-пробирку с низким связыванием, удалив как можно больше лишней жидкости. Гомогенизация и экстракция ДНК. Гомогенизируйте животное для получения геномной ДНК одним из следующих способов.

Гомогенизация с циклами замораживания и оттаивания. Сразу после шага 2.5 добавьте 100 микролитров буфера для лизиса в ПЦР-пробирку, содержащую тихоходку. Поместите ПЦР-пробирку в жидкий азот на 10 минут, и переместите в нагревательный блок, нагретый до 37 градусов в течение 10 минут.

Повторите этот шаг три раза. Ручное дробление. Под стереомикроскопом раздавите особь наконечником пипетки Р10, прижав животное к стенке ПЦР-трубки, и сразу же добавьте 100 микролитров буфера для лизиса.

Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы произошел лизис. Перенесите весь объем смеси для лизиса в чистую микропробирку объемом 1,5 миллилитра с низким уровнем связывания. Добавьте 100 микролитров буфера для лизиса в ПЦР-пробирку с низким уровнем связывания, которая используется для гомогенизации и теперь пуста.

А после пипетирования переложить смесь в 1,5 микропробирки с низким уровнем связывания. Повторите этот шаг дважды. Добавьте 300 микролитров буфера для лизиса в ПЦР-пробирку с низким связыванием, а после пипетирования переместите смесь в микропробирку с низким связыванием объемом 1,5 миллилитра.

Добавьте в общей сложности 600 микролитров лизисной смеси в спиновую колонку, помещенную в сборную пробирку, и центрифугируйте при 10 000 G в течение одной минуты. Снова подайте поток в колонку и центрифугируйте при 10 000 G в течение одной минуты. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы большая часть геномной ДНК была связана с колонкой.

Добавьте 500 микролитров промывочного буфера в отжимную колонну и центрифугируйте при 10 000 G в течение одной минуты. Перенесите спиновую колонку в чистую микротрубку объемом 1,5 миллилитров. Нанесите 20 микролитров 10 миллимоляров первой передней крестообразной связки на спиновую колонку и подождите пять минут при комнатной температуре.

Центрифугируйте при 10 000 G в течение одной минуты. Буфер для разведения не должен содержать ЭДТА, так как он влияет на ферменты лабораторного препарата. Снова нанесите поток на спиновую колонну и после пятиминутной инкубации при комнатной температуре, центрифугируйте в течение одной минуты при 10 000 G. Секвенирование библиотечной конструкции.

Фрагментация ДНК. Перенесите 15 микролитров геномной ДНК в микропробирку объемом 15 микролитров для фрагментации ДНК и центрифугируйте в течение одной минуты с помощью настольной центрифуги. Фрагментируйте геномную ДНК до 550 пар оснований.

После проведения пипетирования перенесите 10 микролитров фрагментированной смеси ДНК в чистую ПЦР-пробирку с низким уровнем связывания. На этом эксперимент можно остановить. Сохраняют ДНК при температуре четыре или минус 20 градусов.

Построение библиотеки секвенсирования. Использование указанного набора абсолютно необходимо в следующих процедурах из-за низкого уровня входной ДНК. Подготовьте необходимые реагенты, следуя протоколу производителя, и сконструируйте библиотеку секвенирования без каких-либо изменений.

После нанесения библиотечной амплификационной смеси на библиотечную смесь синтеза проводят реакцию ПЦР в термическом амплификаторе. Реакцию ПЦР проводили, как показано. Очистка реакции ПЦР.

Добавьте 50 микролитров магнитных шариков и пипетку 10 раз и кратковременно центрифугируйте с помощью настольной микроцентрифуги. Выдерживать в течение двух минут при комнатной температуре. Инкубируйте на магнитной подставке в течение пяти минут, или до тех пор, пока раствор не станет полностью прозрачным, и удалите надосадочную жидкость.

Следуйте протоколу производителя. Перенесите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу, в новую ПЦР-пробирку с низким связыванием. Проверка качества ДНК и количественная оценка, а также секвенирование.

Валидация распределения размеров библиотеки ДНК. Добавьте три микролитра пробной воды с одним микролитром библиотеки секвенирования и тщательно перемешайте в течение одной минуты с помощью вихря, а затем кратковременно центрифугируйте с помощью настольной центрифуги. Проведите электрофорез и проверьте распределение размеров библиотеки с помощью соответствующего программного обеспечения.

Пик основного фрагмента должен находиться в широком диапазоне от 300 до 1000 пар оснований. Количественная оценка ДНК. Добавьте 796 микролитров буфера раствора и четыре микролитра флуоресцентного реагента и тщательно перемешайте.

В две пробирки для анализа распределите 190 микролитров рабочего раствора, а в одну пробирку для анализа – 197 микролитров. В каждую пробирку, содержащую 190 микролитров рабочего раствора, добавить 10 микролитров эталонов с известными концентрациями ДНК, а в пробирку, содержащую 197 микролитров рабочего раствора, добавить три микролитра подготовленной библиотеки. Кратко переведите вихрь и центрифугируйте на настольной центрифуге.

Количественно оцените ДНК с помощью флуориметра с настройками трех микролитров. Секвенирование библиотеки ДНК. Подготовьте библиотеку секвенирования на основе протокола производителя.

Установите кассету с реагентами и проточную ячейку в прибор для секвенирования и введите информацию о ходе секвенирования, следуя протоколу производителя. Запустите секвенирование. Представленные результаты.

Воздействие загрязняющих веществ при высококачественной экстракции ДНК остается критическим моментом в нашем протоколе. Чтобы визуально проверить, являются ли они загрязненными, мы инкубировали тихоходку в антибиотиках, которыми являются пенициллин и стрептомицин, а также исследовали человека под микроскопом 500 раз. Как показано здесь, видимые микробы вокруг тихоходок полностью освещены.

После эффективной гомогенизации, экстракции ДНК, фрагментации и подготовки библиотеки. Распределение библиотеки по размерам проверяется с помощью высокочувствительного электрофореза для контроля качества. Фиолетовая и зеленая линии обозначают верхние и нижние маркеры на 1, 500 и 25 парах оснований соответственно.

Полоса L — это маркер лестницы, полоса S и полоса от N1 до N4 — это пять повторений одного и того же эксперимента, все они начинаются с одного экземпляра тихоходки. Как видно из широкого равномерного распределения между 200 и 1000 парами оснований, наш протокол обладает высокой воспроизводимостью даже при сверхнизких входных данных. Вот результат быстрого контроля качества для синхронизированных чтений, полученных за один прогон секвенирования.

Чтения получаются в виде запасных концов 300 пар оснований, где сверху и снизу показаны прямые и обратные чтения соответственно. Показанное здесь распределение типично для 300 парных операций чтения на концах, при этом очень высокое качество вызова базы выше Q30 для первых 200 пар оснований и постепенно снижается к концу. Таким образом, в этом методе используется только одна особь для одного образца.

Нет никаких требований к огромному количеству животных, как это требовалось в предыдущих проектах секвенирования генома тихоходок. Методы культивирования для большинства тихоходок еще не установлены. Таким образом, возможность секвенирования геномики у одной особи, например, непосредственно в полевых условиях, окажет большое влияние на молекулярную биологию тихоходок и, возможно, на других мелких животных.

Наши методы секвенирования ДНК позволяют анализировать другие многочисленные микроскопические организмы, которые еще не были секвенированы, такие как редкие виды борщевика, нематоды, водяные ели и другие варианты, соединяя часть зон и более широкую общественную территорию, способствуя созданию условий, в которых могут быть возможны различные биологические механизмы.