Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы
25 августа 2018 г.
Здесь мы представляем organotypic культивирование протокол вырастить эмбриональные куриные органов в пробирке. С помощью этого метода, развитие эмбриона курицы ткани могут быть изучены, сохраняя при этом высокую степень контроля над окружающей среде культуры.
Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить доступ к эмбриональным глазам курицы в условиях in-vitro, чтобы обеспечить углубленное изучение сложных путей развития эмбриона. У эмбриональных цыплят изучение глаза часто затруднено из-за развития век, движения эмбриона и роста дополнительных эмбриональных тканей. Такие соединения, как лекарства и ингибиторы, также могут оказывать смертельное воздействие на эмбрион, что затрудняет использование этих соединений для модуляции генных путей.
Достижения в области культивирования тканей in vitro позволили ученым изолировать эти ткани и устранить многие из вышеупомянутых барьеров. Преимущество нашего протокола заключается в том, что он позволяет нам изучать глаз в целом, включая все ткани, которые могут взаимодействовать во время развития, такие как нервная сетчатка и пигментный эпителий сетчатки. Начните с автоклавирования материалов, чтобы убедиться, что все растворы и оборудование стерильны перед процедурой.
Для этого в автоклаве помещают два литра дистиллированной воды и один литр раствора для цыплят, а также коробку салфеток, полупористую фильтровальную бумагу, проволочную сетку, емкости для воды и одноразовые стеклянные пипетки. Тщательно простерилизуйте полки и дверцу инкубатора, используя 70% этанол, затем наполните контейнеры автоклавной, дистиллированной водой и нагрейте инкубатор до 37 градусов Цельсия. Подогрейте питательную среду вместе с тюбиком антибиотика пенициллина стрептомицина в инкубаторе.
Постелите бумажное полотенце по всему рабочему месту и простерилизуйте 70% этанолом. Простерилизуйте все щипцы и ножницы. Поместив куриную голову в автоклавный раствор для цыплят, рассеките голову цыпленка пополам по средней линии, оставив немного ткани в такте вокруг каждого глаза.
Дополнительная ткань поможет глазу поддерживать некоторое напряжение в культуре, а также будет способствовать усвоению питательных веществ по всему глазу и предотвратит соскальзывание глаза с фильтровальной бумаги. Эти ткани также служат ориентирами при ориентации глаза при последующем анализе. На время подготовки культуры оставьте рассеченную ткань в солевом растворе для цыплят комнатной температуры.
Приготовьте блюдо из культуры. Поместите две 35-миллиметровые чашки Петри внутрь одной 100-миллиметровой чашки Петри. Поместите по одному столику из проволочной сетки в каждую маленькую посуду.
Поместите полуголовку с глазком на лист фильтровальной бумаги, слегка наклонив, чтобы глаз не соскользнул с бумаги. Переложите салфетку и фильтровальную бумагу в маленькую чашку Петри на столешнице из проволочной сетки. Повторите то же самое с другой половиной головы того же эмбриона.
Добавьте питательную среду в каждую из двух маленьких чашек Петри. Доведите среду до уровня папиросной бумаги. Не погружайте ткань в среду.
Добавьте 50 микролитров антибиотика пенициллина и стокового раствора стрептомицина в питательную среду в каждом блюде с целью профилактики бактериальной инфекции. Положите сложенный кусок тонкой ткани на внутренний край большой чашки Петри и смочите ее дистиллированной водой. Инкубируйте культуру в темном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех дней.
После культивирования удалите ткань из фильтровальной бумаги и зафиксируйте в 4% параформальдегиде. В первом столбце показан глаз HH34, представляющий эмбриональный глаз цыпленка в начале культивирования. Во втором столбце показан эмбриональный глаз цыпленка, культивируемый в течение четырех дней, начиная с HH34.
В третьем столбце показан глаз HH38, что соответствует четырем дням развития in-яйцеклетки после HH34. Панели от A до F не окрашены, в то время как панели от G до I окрашены на фермент щелочную фосфатазу. Верхний ряд, панели от А до С, показывает, что глаз продолжает развиваться на протяжении всей культуры, о чем свидетельствует появление перьевых почек и рост век, обозначенных стрелками на каждой панели.
Средний ряд, панели от D до F, показывает, что сосочки конъюнктивы начинают дегенерировать в культуре. Нижний ряд, панели от G до I, показывает, что пространственно-временная модель индукции склеральных косточек сохраняется в культуре, что служит примером пути развития, который может быть изучен с помощью этого метода. Этот протокол позволяет тканям поддерживать ключевые пространственные и временные аспекты развития на протяжении всей культуры.
Этот протокол представляет собой ключевой шаг вперед в культивировании целых сенсорных органов, предоставляя альтернативную методологию для изучения сложных путей развития.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол органотипического культивирования органов эмбриона цыпленка, в частности, глаза. Этот метод позволяет исследователям изучать развитие эмбриональных тканей в контролируемой среде in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы культивирования in vitro
Теоретическая база
- Изучение глаз эмбрионов цыплят затруднено из-за развития век и движений эмбриона.
- Наличие внезародышевых тканей осложняет анализ развития глаза.
- Использование препаратов и ингибиторов может быть летальным для эмбриона, что препятствует проведению исследований.
- Методы культивирования in vitro позволяют изолировать ткани для дальнейшего изучения.
Цель исследования
- Обеспечение доступа к глазам куриных эмбрионов для исследований развития.
- Обеспечение возможности изучения сложных путей развития.
- Изучение взаимодействий между различными тканями глаза в процессе развития.
Используемые методы
- Автоклавирование материалов для обеспечения стерильности.
- Органотипическое культивирование эмбриональных тканей цыпленка.
- Изоляция глаза и взаимодействующих с ним тканей.
- Углубленный анализ путей развития.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет изучать глаз в целом.
- Можно наблюдать взаимодействия между нейросенсорной сетчаткой и ретинальным пигментным эпителием.
- Исследования могут проводиться без учета летального воздействия соединений на эмбрион.
- Углубление понимания процессов развития глаза.
Выводы
- Протокол органотипического культивирования эффективен для изучения эмбриональных глаз курицы.
- Данный метод позволяет преодолеть ограничения, присущие традиционным исследованиям эмбрионов.
- Он служит платформой для дальнейших исследований в области биологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности и бизнеса
Изучение сложных путей развития in vivo часто ограничено летальностью эмбрионов, недоступностью тканей и токсичностью соединений. Органотипическое культивирование эмбриональных тканей курицы позволяет проводить изолированный контролируемый анализ взаимодействий на уровне органов, сохраняя при этом пространственно-временную динамику развития. Данный подход способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска, предоставляя релевантную заболеванию систему для валидации мишеней и исследования сигнальных путей.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет сохранения архитектуры ткани и межклеточной сигнализации в процессе развития.
- Операционная ценность: снижает зависимость от моделей на целых эмбрионах, сводя к минимуму вариабельность, вызванную движением эмбриона и воздействием летальных соединений.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, позволяя проводить тестирование зависимости «доза-ответ» для ингибиторов и лекарственных препаратов в контексте жизнеспособной ткани.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную платформу для количественного анализа морфологии тканей и экспрессии биомаркеров в динамике.
- Практическая ценность: Способствует воспроизводимости анализа за счет стерильных, определенных условий культивирования и единообразия подготовки тканей.
- Ценность масштабирования: Позволяет проводить параллельную обработку нескольких культур половин головы для сравнительного скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: сохраняются релевантные для заболевания временные рамки развития, что позволяет проводить корреляцию со стадиями развития в яйце, такими как HH34–HH38.
- Снижение механических рисков: сохраняются пространственно-временные закономерности, например, индукция склеральных костей, что поддерживает анализ путей, согласованный с биомаркерами.
- Ценность непрерывности: обеспечивает связь между этапами поиска и доклиническими исследованиями, позволяя проводить лонгитюдное наблюдение за дегенерацией и созреванием тканей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до доклинической оценки, предоставляя воспроизводимую систему для анализа путей развития.
- Открытие биологических механизмов: Обеспечивает проверку гипотез о генных путях посредством локального применения соединений без системной токсичности для эмбриона.
- Скрининг: Позволяет проводить стандартизированную количественную оценку ответов тканей на фармакологические модуляторы.
- Аналитика: Позволяет получать измеримые результаты, включая структурные изменения тканей, паттерны дегенерации и профили экспрессии ферментов.
- Трансляционные исследования: Соответствует требованиям доклинической валидации за счет сохранения темпов развития, сопоставимых с временными рамками in-ovo.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения развития органов чувств в рамках различных проектов и терапевтических областей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет сохранения нативных тканевых взаимодействий и кинетики развития.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость благодаря соблюдению стерильности, использованию определенного состава сред и контролируемой инкубации.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения количества ложноположительных результатов, вызванных летальностью эмбрионов или компенсаторными механизмами.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с поправкой на риск на основе подтвержденной модуляции путей развития.
Рекомендации по реализации
- Требуется соблюдение правил асептики, а также доступ к автоклаву, инкубатору и стерильным инструментам для диссекции.
- Результат зависит от согласованности стадий развития эмбрионов и правильного приготовления питательной среды.
- Для получения достоверных изображений необходима стандартизация ориентации тканей и расположения фильтровальной бумаги.
- Продолжительность культивирования ex vivo ограничена четырьмя днями до начала значительной деградации тканей.
- Требуется оптимизация для конкретных методов анализа, таких как иммунофлуоресценция или ферментативное окрашивание.
