Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях в области нейробиологии, такие как характеристика нейропопуляции или идентификация источников и мишеней систем передачи. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет быстро и легко определить профиль экспрессии заранее выбранного набора генов из одной клетки. Таким образом, этот метод может дать представление о мыши со случайным разнообразием.

Он также может быть применен к другим типам клеток, таким как астроциты и во многих животных моделях. Эта демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку останавливающие и стремящиеся шаги могут быть трудными для изучения, потому что данные требуют определенного количества цитоплазмы для анализа. Перед секционированием подготовьте набор для вскрытия, состоящий из хирургических ножниц, ножниц для тонкой радужной оболочки, двух шпателей, щипцов, диска с бумажным фильтром и цианоакрилатного клея.

Затем пропитайте ледяной раствор для холодной резки карбогином и охладите режущую камеру до минус 20 градусов Цельсия. Далее снимите с животного скальп и вскройте череп. Осторожно извлеките мозг и поместите его в небольшой стакан, наполненный раствором для холодной резки льда.

После этого снимите камеру резки с минус 20 градусов Цельсия и удалите влагу бумажным полотенцем. Тщательно препарируйте мозг, чтобы изолировать интересующую область. Приклейте его к режущей камере и добавьте карбогинированный раствор для холодной резки

С помощью вибратона разрезаем ломтики толщиной 300 микрометров. Перенесите срезы в камеру для отдыха, наполненную кислородным раствором для резки при комнатной температуре, и дайте им восстановиться не менее 30 минут. Для ОТ-ПЦР с одиночными клетками и определения характеристик целевых клеток ограничьте запись всей клетки не более чем 20 минутами, чтобы сохранить мРНКазу.

В конце записи подготовьте 500 микролитровую ПЦР-пробирку, заполненную двумя микролитрами смеси 5xRT и 0,5 микролитрами 20xDTT. Вращайте его и храните на льду. Затем соберите цитоплазму клетки, применяя мягкое отрицательное давление.

Отслеживайте и контролируйте содержимое клетки от попадания в пипетку, сохраняя при этом плотное прилегание и избегайте сбора ядра, если учитываются некоторые гены. В случае гена важно избегать сбора ядра и включать в него набор праймеров, направленных на амплификацию гДНК, чтобы подготовиться к общему загрязнению. Если ядро приближается к кончику пипетки, ослабьте отрицательное давление и отодвиньте пипетку.

Убедитесь, что плотное уплотнение сохранено, и возобновите сбор цитоплазмы в новом месте расположения пипетки. Затем осторожно извлеките пипетку, чтобы сформировать внешний участок, чтобы ограничить загрязнение внеклеточным мусором и способствовать закрытию клеточной мембраны для последующего гистохимического анализа. Имейте в виду, что бугорки, микроманипуляторы, компьютерная клавиатура или компьютерная мышь являются протонными заряженными источниками загрязнения РНКЗ.

Если они были затронуты во время записи, смените перчатки. Затем прикрепите пипетку к экспеллеру и выдавите ее содержимое в пробирку для ПЦР под положительным давлением. Разломайте кончик пипетки в ПЦР-пробирку, чтобы помочь сбору ее содержимого.

Затем, кратковременно центрифугируя пробирку, добавьте 0,5 микролитра ингибитора РНКазы и 0,5 микролитра РТАзы. Аккуратно перемешайте, снова центрифугируйте и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день раскрутите трубку и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до нескольких месяцев.

До ПЦР-анализа и выполнения первого этапа ампликации. Для валидации ПЦР смешайте и разбавьте пару праймеров, добавьте один микромоляр с помощью пипетки, предназначенной для RTPCR одной клетки. Установите термоамплификатор на три минуты при температуре 95 градусов Цельсия, выполните 40 циклов, а затем выполните заключительный шаг удлинения при температуре 72 градуса Цельсия в течение пяти минут.

Чтобы свести к минимуму образование димеров праймера, выполните горячий пуск, поместив пробирки ПЦР в термоамплификатор, предварительно нагретый до 95 градусов Цельсия. Через 30 секунд быстро вылейте 20 микролитров грунтовочной смеси поверх масла. После того, как праймерная пара будет проверена, протестируйте ее с помощью протокола мультиплексирования.

Смешайте и разведите наружный праймер вместе на одном микромоляре. Храните мультиплексную грунтовочную смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия до нескольких недель. Далее приготовьте предварительную смесь и выложите ее на лед.

Переверните пробирку для ПЦР, вращайте ее и добавьте две капли минерального масла. Через три минуты при температуре 95 градусов Цельсия проведите 20 циклов ПЦР. Выполните горячий пуск, как описано, с помощью 20 микролитров мультиплексной грунтовочной смеси.

Затем подготовьте количество ПЦР-пробирок, идентичное количеству анализируемых генов. Приготовьте предварительную смесь, используя один микролитр первого продукта ПЦР на каждый ген в качестве шаблона. Отрегулируйте все объемы в соответствии с количеством анализируемых генов и рассмотрите возможность использования 10% дополнительного объема для компенсации ошибок пипетирования.

Слегка встряхните, поверните пробирку и налейте 80 микролитров премикса в каждую пробирку для ПЦР. Добавьте две капли минерального масла на тюбик, не касаясь стенки или крышки тюбика. Запустите 35 циклов ПЦР, затем выполните горячий запуск, выдавив 20 микролитров внутренней смеси грунтовки.

Проанализируйте вторые ПЦР-проекты методом электрофореза в арагозном геле. Пирамидальный нейрон пятого слоя был визуально идентифицирован по его большой соме и заметному апикальному дендриту. Запись с помощью пуллинг-клеток выявила типичные электрофизиологические свойства регулярных спайковых нейронов пятого слоя с низким входным сопротивлением, длительными потенциалами действия и выраженной адаптацией к спайковой частоте.

Молекулярный анализ этого нейрона выявил экспрессию vGluT1, подтвердив его глутамитергический фенотип. Этот нейрон также экспрессировал соматостатин и АТФ1-альфа-1 и три субъединицы натрий-калийных АТФ. Биоцитиновое мечение зарегистрированных нейронов, подтвердило пирамидальную морфологию.

Как и ожидалось от глутамитергических нейронов, молекулярный анализ 26 пирамидальных клеток пятого слоя выявил экспрессию vGluT1, но ни одного из двух GAD. Один раз методику можно сделать в течение двух дней, если она правильно отформована. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости быть очень осторожным, чтобы избежать загрязнения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать экспрессию 10 генов одновременно из отдельных клеток, характеризующихся сгустками пятен в соответствии с срезами мозга, после сбора цитоплазмы, обратной транскрипции и ПЦР с горячим запуском. Не забывайте, что работа с бромидом этидия может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов.